人類(lèi)紅細(xì)胞酯酶D的多態(tài)性檢測(cè)與分析
作者：張吉生
單位：張吉生(湖北省咸寧市咸安區(qū)人民檢察院技術(shù)科，咸寧 437000)
關(guān)鍵詞：
咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)000228 中圖分類(lèi)號(hào) R446.11+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B
文章編號(hào) 1008-0635(2000)02-0136-02
本文使用改良的非平衡pH梯度電泳技術(shù)對(duì)咸寧地區(qū)200名漢人酯酶D(EsD)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，旨在建立一種簡(jiǎn)明、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步提高EsD在法醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用價(jià)值而提供參考數(shù)據(jù)。
1 材料和方法
1.1樣品處理
, 百拇醫(yī)藥
取抗凝靜脈血1.0ml用生理鹽水洗三次，每次2000rpm/5min，取壓積紅細(xì)胞加等量蒸溜水混勻，置-20℃冰箱中過(guò)夜，凍融后高速離心20000rpm/15min，取上清液一滴加等量0.05M DTT液作用15min后電泳。
1.2 主要試劑
兩性電解質(zhì)pH4～6.5 40%。丙烯酰胺氯仿重結(jié)晶。N*N'-亞甲基雙丙烯酰胺，化學(xué)純，丙酮重結(jié)晶。過(guò)硫酸銨，優(yōu)極純。蔗糖，分析純。四甲基乙二胺，分析純。二硫基蘇糖醇(DTT)。4-甲基傘形酮醋酸鹽。
1.3 主要儀器
LKB-2197三恒電源。LKB-2219MultitmpⅡ型冷卻水循環(huán)機(jī)。LKB-2117MultitmpⅡ型多功能電泳槽。
1.4 方法
, 百拇醫(yī)藥
1.4.1 凝膠規(guī)格
膠板大小100mm×70mm×0.3mm。聚丙烯酰胺凝膠總濃度T5.5%，交聯(lián)度C4.5%，兩性電解質(zhì)濃度3%，蔗糖12.3%。
1.4.2 點(diǎn)樣
用加樣濾紙(5mm×5mm)蘸取處理好樣品約10μl貼在膠板上離負(fù)極端1.5cm處。
1.4.3 電泳
正極液：1M H3PO4，負(fù)極液：0.2N NaOH，電極間距7cm，循環(huán)水溫4℃，250V預(yù)聚焦8分鐘，加樣后調(diào)至500V，電流不限，電泳10min，去樣后，再將電壓調(diào)至1000V電泳40min。
1.4.4 顯色
, http://www.www.srpcoatings.com
取2mg 4-甲基傘形酮醋酸鹽，加丙酮一滴助溶后，再加醋酸緩沖液(pH5.2)5.0ml混勻，濕潤(rùn)大小為10cm×7cm的濾紙一張，復(fù)蓋凝膠表面，37℃孵化3～5min，置長(zhǎng)波紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。
2 結(jié) 果
在200例血樣檢測(cè)中，除EsD三種普通型外，還發(fā)現(xiàn)了EsD7-1和EsD7-2型。
200例EsD的表現(xiàn)型和基因頻率見(jiàn)表1。上述結(jié)果，經(jīng)遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，各表現(xiàn)型觀(guān)察值與期望值之間無(wú)顯著性差異，符合Hardy-Weinberg平衡定律，并依據(jù)有關(guān)公式算出非父排除率EPP為0.1944，鑒別機(jī)率為0.6390。
表1 EsD的表現(xiàn)型和基因頻率 表現(xiàn)型
觀(guān)察值(%)
期望值
, http://www.www.srpcoatings.com
基因頻率
EsD1
83(41.5)
83.6
EsD1=0.630
EsD2-1
88(44.0)
87.2
EsD2=0.330
EsD2
24(12.0)
23.7
, http://www.www.srpcoatings.com
EsD7=0.015
EsD7-1
4(2.0)
3.6
EsD7-2
2(1.0)
1.9
df=3，0.9>P>0.75
3 討 論
3.1EsD的多態(tài)性
EsD是一類(lèi)能夠水解羧酸酯鍵的酶，60年代以來(lái)，用紅細(xì)胞溶血液電泳，共發(fā)現(xiàn)4種非特異人紅細(xì)胞酯酶A、B、C、D，但酯酶A遺傳變異罕見(jiàn)，酯酶B沒(méi)有異體，唯酯酶D具有多態(tài)性。
, 百拇醫(yī)藥
EsD多態(tài)性表現(xiàn)型是Hopkison等用淀粉凝膠電泳法，以4-甲基傘形酮醋酸鹽或丁酸鹽為底物進(jìn)行熒光顯影而發(fā)現(xiàn)的，其分子量為6000，最適pH為5.0～5.5，其遺傳控制是由常染色體等位基因按共顯性遺傳，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EsD至少有18種等位基因。
用普通電泳法可將EsD基因產(chǎn)物分為EsP1、EsP2-1、EsP2三種表現(xiàn)型，用普通等電聚焦電泳能檢出EsD多種基因產(chǎn)物，但對(duì)EsD1、EsD2的分離效果極差，因?yàn)樗麄兊牡入婞c(diǎn)十分接近。運(yùn)用超薄聚丙烯酰胺凝膠非平衡pH梯度電泳方法檢測(cè)EsD，其結(jié)果能檢出更多的EsD的基因產(chǎn)物，譜帶分離更為清晰，還能發(fā)現(xiàn)EsD7-1、EsD7-2兩型。
3.2 實(shí)驗(yàn)方法的改良
本實(shí)驗(yàn)采用超薄聚丙烯酰胺凝膠非平衡pH梯度電泳，使用時(shí)作了某些修改，節(jié)省了試劑，但不影響結(jié)果，改變了常規(guī)使用時(shí)的膠濃度(T7%改為5.5%)和膠聯(lián)度(C3.3%改為4.5%)，增強(qiáng)了膠的強(qiáng)度，電極間距較原始作了縮短，僅為6.8cm，催化劑改為過(guò)硫酸銨，可使膠快速凝聚，加樣后低電壓，去樣后提高電壓，大大減輕了譜帶的扭曲現(xiàn)象，提高了分辨率。
(本實(shí)驗(yàn)得到同濟(jì)醫(yī)大法醫(yī)系的幫助，謹(jǐn)此致謝)
收稿2000-03-27, 百拇醫(yī)藥
單位：張吉生(湖北省咸寧市咸安區(qū)人民檢察院技術(shù)科，咸寧 437000)
關(guān)鍵詞：
咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)000228 中圖分類(lèi)號(hào) R446.11+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B
文章編號(hào) 1008-0635(2000)02-0136-02
本文使用改良的非平衡pH梯度電泳技術(shù)對(duì)咸寧地區(qū)200名漢人酯酶D(EsD)多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，旨在建立一種簡(jiǎn)明、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，為進(jìn)一步提高EsD在法醫(yī)學(xué)中的運(yùn)用價(jià)值而提供參考數(shù)據(jù)。
1 材料和方法
1.1樣品處理
, 百拇醫(yī)藥
取抗凝靜脈血1.0ml用生理鹽水洗三次，每次2000rpm/5min，取壓積紅細(xì)胞加等量蒸溜水混勻，置-20℃冰箱中過(guò)夜，凍融后高速離心20000rpm/15min，取上清液一滴加等量0.05M DTT液作用15min后電泳。
1.2 主要試劑
兩性電解質(zhì)pH4～6.5 40%。丙烯酰胺氯仿重結(jié)晶。N*N'-亞甲基雙丙烯酰胺，化學(xué)純，丙酮重結(jié)晶。過(guò)硫酸銨，優(yōu)極純。蔗糖，分析純。四甲基乙二胺，分析純。二硫基蘇糖醇(DTT)。4-甲基傘形酮醋酸鹽。
1.3 主要儀器
LKB-2197三恒電源。LKB-2219MultitmpⅡ型冷卻水循環(huán)機(jī)。LKB-2117MultitmpⅡ型多功能電泳槽。
1.4 方法
, 百拇醫(yī)藥
1.4.1 凝膠規(guī)格
膠板大小100mm×70mm×0.3mm。聚丙烯酰胺凝膠總濃度T5.5%，交聯(lián)度C4.5%，兩性電解質(zhì)濃度3%，蔗糖12.3%。
1.4.2 點(diǎn)樣
用加樣濾紙(5mm×5mm)蘸取處理好樣品約10μl貼在膠板上離負(fù)極端1.5cm處。
1.4.3 電泳
正極液：1M H3PO4，負(fù)極液：0.2N NaOH，電極間距7cm，循環(huán)水溫4℃，250V預(yù)聚焦8分鐘，加樣后調(diào)至500V，電流不限，電泳10min，去樣后，再將電壓調(diào)至1000V電泳40min。
1.4.4 顯色
, http://www.www.srpcoatings.com
取2mg 4-甲基傘形酮醋酸鹽，加丙酮一滴助溶后，再加醋酸緩沖液(pH5.2)5.0ml混勻，濕潤(rùn)大小為10cm×7cm的濾紙一張，復(fù)蓋凝膠表面，37℃孵化3～5min，置長(zhǎng)波紫外燈下觀(guān)察結(jié)果。
2 結(jié) 果
在200例血樣檢測(cè)中，除EsD三種普通型外，還發(fā)現(xiàn)了EsD7-1和EsD7-2型。
200例EsD的表現(xiàn)型和基因頻率見(jiàn)表1。上述結(jié)果，經(jīng)遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，各表現(xiàn)型觀(guān)察值與期望值之間無(wú)顯著性差異，符合Hardy-Weinberg平衡定律，并依據(jù)有關(guān)公式算出非父排除率EPP為0.1944，鑒別機(jī)率為0.6390。
表1 EsD的表現(xiàn)型和基因頻率 表現(xiàn)型
觀(guān)察值(%)
期望值
, http://www.www.srpcoatings.com
基因頻率
EsD1
83(41.5)
83.6
EsD1=0.630
EsD2-1
88(44.0)
87.2
EsD2=0.330
EsD2
24(12.0)
23.7
, http://www.www.srpcoatings.com
EsD7=0.015
EsD7-1
4(2.0)
3.6
EsD7-2
2(1.0)
1.9
df=3，0.9>P>0.75
3 討 論
3.1EsD的多態(tài)性
EsD是一類(lèi)能夠水解羧酸酯鍵的酶，60年代以來(lái)，用紅細(xì)胞溶血液電泳，共發(fā)現(xiàn)4種非特異人紅細(xì)胞酯酶A、B、C、D，但酯酶A遺傳變異罕見(jiàn)，酯酶B沒(méi)有異體，唯酯酶D具有多態(tài)性。
, 百拇醫(yī)藥
EsD多態(tài)性表現(xiàn)型是Hopkison等用淀粉凝膠電泳法，以4-甲基傘形酮醋酸鹽或丁酸鹽為底物進(jìn)行熒光顯影而發(fā)現(xiàn)的，其分子量為6000，最適pH為5.0～5.5，其遺傳控制是由常染色體等位基因按共顯性遺傳，到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)EsD至少有18種等位基因。
用普通電泳法可將EsD基因產(chǎn)物分為EsP1、EsP2-1、EsP2三種表現(xiàn)型，用普通等電聚焦電泳能檢出EsD多種基因產(chǎn)物，但對(duì)EsD1、EsD2的分離效果極差，因?yàn)樗麄兊牡入婞c(diǎn)十分接近。運(yùn)用超薄聚丙烯酰胺凝膠非平衡pH梯度電泳方法檢測(cè)EsD，其結(jié)果能檢出更多的EsD的基因產(chǎn)物，譜帶分離更為清晰，還能發(fā)現(xiàn)EsD7-1、EsD7-2兩型。
3.2 實(shí)驗(yàn)方法的改良
本實(shí)驗(yàn)采用超薄聚丙烯酰胺凝膠非平衡pH梯度電泳，使用時(shí)作了某些修改，節(jié)省了試劑，但不影響結(jié)果，改變了常規(guī)使用時(shí)的膠濃度(T7%改為5.5%)和膠聯(lián)度(C3.3%改為4.5%)，增強(qiáng)了膠的強(qiáng)度，電極間距較原始作了縮短，僅為6.8cm，催化劑改為過(guò)硫酸銨，可使膠快速凝聚，加樣后低電壓，去樣后提高電壓，大大減輕了譜帶的扭曲現(xiàn)象，提高了分辨率。
(本實(shí)驗(yàn)得到同濟(jì)醫(yī)大法醫(yī)系的幫助，謹(jǐn)此致謝)
收稿2000-03-27, 百拇醫(yī)藥