武漢地區(qū)獻(xiàn)血員血清TTV等幾種肝炎相關(guān)病毒的基因檢測
作者：李方和 楊燕 喻植群 朱凡 汪由坤 張俊 趙西平 楊東亮
單位：(同濟醫(yī)科大學(xué)附屬同濟醫(yī)院臨床免疫研究室，武漢 430030)
關(guān)鍵詞：輸血；肝炎；TTV DNA
咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報000208 摘 要 目的：了解武漢地區(qū)不同獻(xiàn)血員血清TTV感染特點及其與其它幾種肝炎相關(guān)病毒感染之間的關(guān)系。方法：采用PCR及巢式PCR對54例武漢市城區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員及74例既往鄉(xiāng)村獻(xiàn)血者分別進(jìn)行血清TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA等檢測。結(jié)果：TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA指標(biāo)陽性率在既往鄉(xiāng)村個體獻(xiàn)血員為43.2%、23.0%與2.7%，城區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員為5.6%、1.9%與1.9%，前者TTV DNA與HCV RNA檢出率較后者顯著升高(P<0.01)，兩組TTV DNA的檢出率顯著高于其他肝炎相關(guān)病毒。結(jié)論：武漢地區(qū)獻(xiàn)血員人群存在TTV感染，長期的既往獻(xiàn)血過程可使職業(yè)獻(xiàn)血員TTV與HCV感染率升高；由此造成的TTV在部分鄉(xiāng)村特殊人群中的流行已經(jīng)成為武漢地區(qū)一個值得關(guān)注的流行病學(xué)問題。
, 百拇醫(yī)藥
中圖分類號 R512.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A
文章編號 1008-0635(2000)02-0100-03
Detection of TTV DNA and Other Hepatitis Virus in
Sera of Blood Donors in WUHAN Area
LI Fanghe YANG Yan YU Zhiqun et al
(Clinic Immunology Research Unit,Tongji Hospital,Tongji Medical Uniwersity,Wuhan 430030)
ABSTRACT Objective To investigate the infective characteristics of TTV and the relationship between it and otter hepatitis-associate viruses infection in sera of blood donors in Wuhan area.Methods PCR or RT nested PCR were adopted to detection TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA in sera of 54 volunteers and 74 professional blood donors.Results The detection rate of TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA were 43.2%,23.0% and 2.7% in professional group and 5.6%,1.9% and 1.9% in voluntteer;the positive rate of TTV DNA and HCV RNA in the former group were obviously higher than in latter(P<0.01).And in two groups,the detectioc rate of TTV DNA was significantly higher than the other hepatitis viruses.Conclusion In professional blood donors there is a high risk for TTV tansmission.
, 百拇醫(yī)藥
KEY WORDS Blood transfusion；Hepatitis；TTV DNA
采用PCR技術(shù)對一組武漢地區(qū)現(xiàn)行與既住獻(xiàn)血員進(jìn)行血清TTV DNA與其他幾種新近發(fā)現(xiàn)肝炎相關(guān)病毒的檢測，并對三者在不同獻(xiàn)血員中的表達(dá)狀況及其相互之間的關(guān)系進(jìn)行了比較，現(xiàn)報道如下。
1 材料及方法
1.1標(biāo)本
武漢地區(qū)獻(xiàn)血員血清128份，包括市郊鄉(xiāng)村既往個體職業(yè)獻(xiàn)血員(均多次獻(xiàn)血)血清74份，市區(qū)內(nèi)義務(wù)獻(xiàn)血員(均無獻(xiàn)血史)血清54份，分別于1997年4月(鄉(xiāng)村既往個體就血員)與1998年10月(武漢市區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員)采集，分離血清，置-70℃凍存至檢測。全部受檢者獻(xiàn)血體檢均合格。血清抗-HCV及HBsAg陰性，ALT測值在正常水平。
1.2 試劑
, 百拇醫(yī)藥
血清TTV DNA PCR檢測引物由本室根據(jù)Okamoto等報道的序列進(jìn)行設(shè)計，擴增產(chǎn)物長度為122bp。上海生工公司合成[2，3]，擴增產(chǎn)物長度為1226p。引物系列為外引物：
T1：TATGTTACACACTCAGACG-3′
T2：GAGCCGAACGGATATTGC-3′
內(nèi)引物：
T3：GCCACACACTCAGACGATAC-3′
T4：TGAGGCTGTCCAGTAGTTCA-3′，HCV RNA 及HGV RNA PCR檢測的引物亦為臨床免疫研究室提供。
AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs及Taq DNA合成酶等自Promega公司購得。
, 百拇醫(yī)藥
1.3 實驗方法
1.3.1 核酸提取
取血清50ul，以異硫氫酸胍-糖原液列解病毒，酚和氯仿加異戊醇(100∶49∶1)抽提，異丙醇沉淀，乙醇(75%)洗滌，涼干后溶解于50ul經(jīng)DEPC處理后的蒸餾水中，-30℃凍存。
1.3.2 TTV DNA檢測
PCR參見以往報道[1～3]，主要步驟為：模板提取；加入反應(yīng)體系(引物各0.2umol，Taq DNA聚合酶1u)；PCR擴增(94℃/30sec,57℃/30sec,72℃/30sec，共35循環(huán))；產(chǎn)物的電泳與鑒定等。
1.3.3 HCV RNA與HGV RNA檢測
根據(jù)以往報道[1～3]。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié) 果
2.1幾種肝炎相關(guān)病毒基因檢測結(jié)果
采用PCR技術(shù)對128份血清標(biāo)本進(jìn)行了TTV DNA、HCV RNA和HGV RNA三種肝炎相關(guān)病毒基因物質(zhì)的檢測，實驗結(jié)果見表1。
表1 武漢地區(qū)獻(xiàn)血員血清三種肝炎病毒基因檢測結(jié)果 檢測項目
檢測例數(shù)
義務(wù)獻(xiàn)血員
個體職業(yè)獻(xiàn)血員
例數(shù)
陽性數(shù)
%
例數(shù)
, 百拇醫(yī)藥
陽性數(shù)
%
TTV
128
54
3
5.56
74
32
43.24*
HCV
128
54
, 百拇醫(yī)藥
1
1.85
74
17
22.97*
HGV
128
54
1
1.85
74
2
2.70
, 百拇醫(yī)藥
與義務(wù)獻(xiàn)血員組比較*P<0.01
2.2 三種肝炎病毒基因物質(zhì)檢測結(jié)果間的關(guān)系
對TTV感染與HCV和HGV兩種肝炎相關(guān)病毒感染的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。HCV RNA陽性者TTV DNA檢測陽性率為77.8%(14/18)，顯著高于HCV RNA檢測陰性者(4.0%，4/100，P<0.001)；HGV RNA檢測陽性與陰性者中TTV DNA檢出率分別為0%(0/3)與43.3%(35/80)，HGV RNA陽性者TTV DNA檢出率較陰性者高，兩者有顯著性差別(P<0.05)。表2 TTV感染與其他兩種肝炎相關(guān)病毒感染的關(guān)系
HCV
HGV
+
-
, 百拇醫(yī)藥
+
-
TTV
+
14
21
0
35
-
4
79
3
80
2.3 重復(fù)感染狀況
, http://www.www.srpcoatings.com
對個體獻(xiàn)血與義務(wù)獻(xiàn)血組TTV、HCV和HGV肝炎病毒重復(fù)感染的狀況做進(jìn)一步分析，結(jié)果見表3。表3 獻(xiàn)血員人群TTV、HCV和HGV混合感染狀況 組 別
例數(shù)
未感染
單一感染(%)
重疊感染(%)
職業(yè)獻(xiàn)血
74
38
20(27.03)
16(21.62)
義務(wù)獻(xiàn)血
, 百拇醫(yī)藥
54
49
5(8.33)
0(0.00)
3 討 論
TTV是自甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后，日本學(xué)者Nishazawa新近發(fā)現(xiàn)的又一種肝炎相關(guān)病毒。獻(xiàn)血員人群陽性率為12%，血友病患者檢出率為46%，各型非甲—非戊肝病患者中的感染率在39%～52.5%之間[2～4]。國內(nèi)最新研究顯示密切的生活接觸是其傳播的另一重要因素[4]。一系列研究曾顯示職業(yè)獻(xiàn)血員及其該人群高度集聚地區(qū)HCV的感染率較正常人群顯著為高[5]，但TTV感染狀況的調(diào)查迄今尚未見報道。本研究對武漢地區(qū)一組既往職業(yè)獻(xiàn)血員血清作TTV DNA檢測，并與無獻(xiàn)血史的義務(wù)獻(xiàn)血員進(jìn)行比較。兩者分別為43.2%及5.6%，職業(yè)獻(xiàn)血員高度集聚地區(qū)既往獻(xiàn)血者的檢測陽性率顯著地高于自愿獻(xiàn)血者人群。對上述人群同時做血清HCV RNA與HGV RNA檢測，前者較義務(wù)獻(xiàn)血組顯著升高，推測系HCV主要經(jīng)血液傳播所致，后者陽性率較低，兩組間未見顯著差別。本組資料還顯示血清TTV DNA陽性者HCV RNA檢出陽性率高達(dá)77.8%，顯著高于TTV陰性組的4.0%，病毒重疊感染者例數(shù)前者亦高于后者。結(jié)合本地區(qū)獻(xiàn)血工作既往狀況，以及作者早期對該地區(qū)獻(xiàn)血員HBV及HCV感染的調(diào)查結(jié)果分析，我們有理由推測這一現(xiàn)象與管理不善的個體有償獻(xiàn)血有關(guān)。因而證實加大輸血工作管理力度，推廣以義務(wù)獻(xiàn)血取代有償獻(xiàn)血的政策，對我國控制輸血相關(guān)性疾病的傳播是非常必要的。然而，盡管我國多數(shù)地區(qū)(包括武漢地區(qū))有償獻(xiàn)血己經(jīng)取消，但并不意味著由此造成的特定人群中TTV與HCV的區(qū)域性流行已經(jīng)停止。在鄉(xiāng)村不良衛(wèi)生狀況下TTV(同時包括HCV)將會通過密切的生活接觸進(jìn)一步傳播，并可能在一定范圍內(nèi)造成流行。這一現(xiàn)象應(yīng)該引起衛(wèi)生管理部門的高度重視。
, http://www.www.srpcoatings.com
參考文獻(xiàn)
1，Nishizawa T.Okamoto H,Knishi K,et al.A novel DNA wnus(TTV)associated with elevated transfuminance levels in post-transfusion hepatitis of unknow etioiogy.Biochem Biophys Res Commun,1997；241：92
2，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mclecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with post-transfusion hepatitis of unknown euology.Hepatology research,1998，10：1
3，周伯平，馬為民，孫彤，等.TTV在非甲-庚型肝炎患者中的檢測、克隆及測序.中華傳染病學(xué)雜志，1998；16：131
4，譚復(fù)明，駱抗先，王志明，等.輸血后乙型和丙型肝炎毒性感染的前瞻性調(diào)查.中華肝臟病雜志，1997；5：42
5，李方和，黃元成，唐振亞，等.丙型肝炎病毒在供、受血者間傳播的調(diào)查.同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，16(3)：18
收稿1999-11-09
, 百拇醫(yī)藥
單位：(同濟醫(yī)科大學(xué)附屬同濟醫(yī)院臨床免疫研究室，武漢 430030)
關(guān)鍵詞：輸血；肝炎；TTV DNA
咸寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報000208 摘 要 目的：了解武漢地區(qū)不同獻(xiàn)血員血清TTV感染特點及其與其它幾種肝炎相關(guān)病毒感染之間的關(guān)系。方法：采用PCR及巢式PCR對54例武漢市城區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員及74例既往鄉(xiāng)村獻(xiàn)血者分別進(jìn)行血清TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA等檢測。結(jié)果：TTV DNA、HCV RNA及HGV RNA指標(biāo)陽性率在既往鄉(xiāng)村個體獻(xiàn)血員為43.2%、23.0%與2.7%，城區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員為5.6%、1.9%與1.9%，前者TTV DNA與HCV RNA檢出率較后者顯著升高(P<0.01)，兩組TTV DNA的檢出率顯著高于其他肝炎相關(guān)病毒。結(jié)論：武漢地區(qū)獻(xiàn)血員人群存在TTV感染，長期的既往獻(xiàn)血過程可使職業(yè)獻(xiàn)血員TTV與HCV感染率升高；由此造成的TTV在部分鄉(xiāng)村特殊人群中的流行已經(jīng)成為武漢地區(qū)一個值得關(guān)注的流行病學(xué)問題。
, 百拇醫(yī)藥
中圖分類號 R512.6 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A
文章編號 1008-0635(2000)02-0100-03
Detection of TTV DNA and Other Hepatitis Virus in
Sera of Blood Donors in WUHAN Area
LI Fanghe YANG Yan YU Zhiqun et al
(Clinic Immunology Research Unit,Tongji Hospital,Tongji Medical Uniwersity,Wuhan 430030)
ABSTRACT Objective To investigate the infective characteristics of TTV and the relationship between it and otter hepatitis-associate viruses infection in sera of blood donors in Wuhan area.Methods PCR or RT nested PCR were adopted to detection TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA in sera of 54 volunteers and 74 professional blood donors.Results The detection rate of TTV DNA,HCV RNA and HGV RNA were 43.2%,23.0% and 2.7% in professional group and 5.6%,1.9% and 1.9% in voluntteer;the positive rate of TTV DNA and HCV RNA in the former group were obviously higher than in latter(P<0.01).And in two groups,the detectioc rate of TTV DNA was significantly higher than the other hepatitis viruses.Conclusion In professional blood donors there is a high risk for TTV tansmission.
, 百拇醫(yī)藥
KEY WORDS Blood transfusion；Hepatitis；TTV DNA
采用PCR技術(shù)對一組武漢地區(qū)現(xiàn)行與既住獻(xiàn)血員進(jìn)行血清TTV DNA與其他幾種新近發(fā)現(xiàn)肝炎相關(guān)病毒的檢測，并對三者在不同獻(xiàn)血員中的表達(dá)狀況及其相互之間的關(guān)系進(jìn)行了比較，現(xiàn)報道如下。
1 材料及方法
1.1標(biāo)本
武漢地區(qū)獻(xiàn)血員血清128份，包括市郊鄉(xiāng)村既往個體職業(yè)獻(xiàn)血員(均多次獻(xiàn)血)血清74份，市區(qū)內(nèi)義務(wù)獻(xiàn)血員(均無獻(xiàn)血史)血清54份，分別于1997年4月(鄉(xiāng)村既往個體就血員)與1998年10月(武漢市區(qū)義務(wù)獻(xiàn)血員)采集，分離血清，置-70℃凍存至檢測。全部受檢者獻(xiàn)血體檢均合格。血清抗-HCV及HBsAg陰性，ALT測值在正常水平。
1.2 試劑
, 百拇醫(yī)藥
血清TTV DNA PCR檢測引物由本室根據(jù)Okamoto等報道的序列進(jìn)行設(shè)計，擴增產(chǎn)物長度為122bp。上海生工公司合成[2，3]，擴增產(chǎn)物長度為1226p。引物系列為外引物：
T1：TATGTTACACACTCAGACG-3′
T2：GAGCCGAACGGATATTGC-3′
內(nèi)引物：
T3：GCCACACACTCAGACGATAC-3′
T4：TGAGGCTGTCCAGTAGTTCA-3′，HCV RNA 及HGV RNA PCR檢測的引物亦為臨床免疫研究室提供。
AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNasin、dNTPs及Taq DNA合成酶等自Promega公司購得。
, 百拇醫(yī)藥
1.3 實驗方法
1.3.1 核酸提取
取血清50ul，以異硫氫酸胍-糖原液列解病毒，酚和氯仿加異戊醇(100∶49∶1)抽提，異丙醇沉淀，乙醇(75%)洗滌，涼干后溶解于50ul經(jīng)DEPC處理后的蒸餾水中，-30℃凍存。
1.3.2 TTV DNA檢測
PCR參見以往報道[1～3]，主要步驟為：模板提取；加入反應(yīng)體系(引物各0.2umol，Taq DNA聚合酶1u)；PCR擴增(94℃/30sec,57℃/30sec,72℃/30sec，共35循環(huán))；產(chǎn)物的電泳與鑒定等。
1.3.3 HCV RNA與HGV RNA檢測
根據(jù)以往報道[1～3]。
, 百拇醫(yī)藥
2 結(jié) 果
2.1幾種肝炎相關(guān)病毒基因檢測結(jié)果
采用PCR技術(shù)對128份血清標(biāo)本進(jìn)行了TTV DNA、HCV RNA和HGV RNA三種肝炎相關(guān)病毒基因物質(zhì)的檢測，實驗結(jié)果見表1。
表1 武漢地區(qū)獻(xiàn)血員血清三種肝炎病毒基因檢測結(jié)果 檢測項目
檢測例數(shù)
義務(wù)獻(xiàn)血員
個體職業(yè)獻(xiàn)血員
例數(shù)
陽性數(shù)
%
例數(shù)
, 百拇醫(yī)藥
陽性數(shù)
%
TTV
128
54
3
5.56
74
32
43.24*
HCV
128
54
, 百拇醫(yī)藥
1
1.85
74
17
22.97*
HGV
128
54
1
1.85
74
2
2.70
, 百拇醫(yī)藥
與義務(wù)獻(xiàn)血員組比較*P<0.01
2.2 三種肝炎病毒基因物質(zhì)檢測結(jié)果間的關(guān)系
對TTV感染與HCV和HGV兩種肝炎相關(guān)病毒感染的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。HCV RNA陽性者TTV DNA檢測陽性率為77.8%(14/18)，顯著高于HCV RNA檢測陰性者(4.0%，4/100，P<0.001)；HGV RNA檢測陽性與陰性者中TTV DNA檢出率分別為0%(0/3)與43.3%(35/80)，HGV RNA陽性者TTV DNA檢出率較陰性者高，兩者有顯著性差別(P<0.05)。表2 TTV感染與其他兩種肝炎相關(guān)病毒感染的關(guān)系
HCV
HGV
+
-
, 百拇醫(yī)藥
+
-
TTV
+
14
21
0
35
-
4
79
3
80
2.3 重復(fù)感染狀況
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對個體獻(xiàn)血與義務(wù)獻(xiàn)血組TTV、HCV和HGV肝炎病毒重復(fù)感染的狀況做進(jìn)一步分析，結(jié)果見表3。表3 獻(xiàn)血員人群TTV、HCV和HGV混合感染狀況 組 別
例數(shù)
未感染
單一感染(%)
重疊感染(%)
職業(yè)獻(xiàn)血
74
38
20(27.03)
16(21.62)
義務(wù)獻(xiàn)血
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54
49
5(8.33)
0(0.00)
3 討 論
TTV是自甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后，日本學(xué)者Nishazawa新近發(fā)現(xiàn)的又一種肝炎相關(guān)病毒。獻(xiàn)血員人群陽性率為12%，血友病患者檢出率為46%，各型非甲—非戊肝病患者中的感染率在39%～52.5%之間[2～4]。國內(nèi)最新研究顯示密切的生活接觸是其傳播的另一重要因素[4]。一系列研究曾顯示職業(yè)獻(xiàn)血員及其該人群高度集聚地區(qū)HCV的感染率較正常人群顯著為高[5]，但TTV感染狀況的調(diào)查迄今尚未見報道。本研究對武漢地區(qū)一組既往職業(yè)獻(xiàn)血員血清作TTV DNA檢測，并與無獻(xiàn)血史的義務(wù)獻(xiàn)血員進(jìn)行比較。兩者分別為43.2%及5.6%，職業(yè)獻(xiàn)血員高度集聚地區(qū)既往獻(xiàn)血者的檢測陽性率顯著地高于自愿獻(xiàn)血者人群。對上述人群同時做血清HCV RNA與HGV RNA檢測，前者較義務(wù)獻(xiàn)血組顯著升高，推測系HCV主要經(jīng)血液傳播所致，后者陽性率較低，兩組間未見顯著差別。本組資料還顯示血清TTV DNA陽性者HCV RNA檢出陽性率高達(dá)77.8%，顯著高于TTV陰性組的4.0%，病毒重疊感染者例數(shù)前者亦高于后者。結(jié)合本地區(qū)獻(xiàn)血工作既往狀況，以及作者早期對該地區(qū)獻(xiàn)血員HBV及HCV感染的調(diào)查結(jié)果分析，我們有理由推測這一現(xiàn)象與管理不善的個體有償獻(xiàn)血有關(guān)。因而證實加大輸血工作管理力度，推廣以義務(wù)獻(xiàn)血取代有償獻(xiàn)血的政策，對我國控制輸血相關(guān)性疾病的傳播是非常必要的。然而，盡管我國多數(shù)地區(qū)(包括武漢地區(qū))有償獻(xiàn)血己經(jīng)取消，但并不意味著由此造成的特定人群中TTV與HCV的區(qū)域性流行已經(jīng)停止。在鄉(xiāng)村不良衛(wèi)生狀況下TTV(同時包括HCV)將會通過密切的生活接觸進(jìn)一步傳播，并可能在一定范圍內(nèi)造成流行。這一現(xiàn)象應(yīng)該引起衛(wèi)生管理部門的高度重視。
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參考文獻(xiàn)
1，Nishizawa T.Okamoto H,Knishi K,et al.A novel DNA wnus(TTV)associated with elevated transfuminance levels in post-transfusion hepatitis of unknow etioiogy.Biochem Biophys Res Commun,1997；241：92
2，Okamoto H,Nishizawa T,Kato N,et al.Mclecular cloning and characterization of a novel DNA virus(TTV) associated with post-transfusion hepatitis of unknown euology.Hepatology research,1998，10：1
3，周伯平，馬為民，孫彤，等.TTV在非甲-庚型肝炎患者中的檢測、克隆及測序.中華傳染病學(xué)雜志，1998；16：131
4，譚復(fù)明，駱抗先，王志明，等.輸血后乙型和丙型肝炎毒性感染的前瞻性調(diào)查.中華肝臟病雜志，1997；5：42
5，李方和，黃元成，唐振亞，等.丙型肝炎病毒在供、受血者間傳播的調(diào)查.同濟醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1997，16(3)：18
收稿1999-11-09
, 百拇醫(yī)藥