中國人腦瘤中p16、p15基因缺失分析
作者:田新華 江澄川 高翔 許凱黎 周瑾 陳商群
單位:田新華(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科 太原 030001);江澄川(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科);高翔(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科);許凱黎(上海市腫瘤研究所);周瑾(上海市腫瘤研究所);陳商群(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科)
關鍵詞:腦腫瘤;p16基因;p15基因;基因缺失
中國人腦瘤中p16 〔摘要〕 目的 為了解p16、p15基因與中國人腦腫瘤遺傳易感性的關系。方法 應用PCR、銀染PCR-SSCP及免疫組化法對88例腦腫瘤及相應手術切除正常組織DNA標本p16、p15基因進行研究。結果 結果顯示在不同病理分級腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因缺失率分別為Ⅰ-Ⅱ級4%、0%,Ⅲ級32%、28%,Ⅳ級36%、27%,p16、p15基因缺失主要見于Ⅲ-Ⅳ級腫瘤中;腦轉移瘤中也檢出缺失該基因(2/3),而原發(fā)性非膠質(zhì)細胞瘤(腦膜瘤、垂體瘤、聽神經(jīng)瘤等)中未見p16、p15基因缺失,各類腫瘤標本PCR-SSCP分析均未見p16、p15基因點突變。結論 表明國人腦瘤中p16、p15基因異常以缺失為主,p16、p15基因缺失在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生頻率較高,促進腫瘤細胞由良性向惡性演進,而對良性非膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)病沒有作用。
, 百拇醫(yī)藥
〔中圖分類號〕 R739.41 〔文獻標識碼〕B
Analysis on p16、p15gene deletion in human brain tumor in Chinese
TIAN Xin-hua,JIANG Cheng-chuan,XU Kai-li,et al.
Department of Neurosurgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship between p16(MTS1),p15(MTS2) gene and the susceptibility of brain tumor.Methods 88 brain tumor and its neighbouring normal brain tissues at the resection edge were detected using PCR,silver stain PCR-SSCP and immunohistochemistry.Results The deletion rates of p16,p15 gene were 4% and 0% in gliomas of grade Ⅰ-Ⅱ,32% and 28% of grade Ⅲ,36% and 27% of grade Ⅳ respectively.Deletion of p16,p15 gene also occurred in brain metastatic tumors(2/3).But it did not possibly demonstrate deletion of p16,p15 gene in 17 primary non-astrocytic tumors.Mutation of p16,p15 gene was not been found in a variety of brain tumors by PCR-SSCP.Conclusions These data suggest that deletion of p16,p15 gene may be an efficient and commonly seen mechanism of simultaneous inactivation for gliomas,which is associated with the malignant progression of gliomas.On top of this,p16 and p15 gene dose not play a role in the pathogenesis of cerebral non-astrocytic tumors.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 brain tumors;p16 gene;p15 gene;gene deletion
多腫瘤抑制基因(Multiple tumor suppressor,MTS)MTS1/p16、MTS2/p15是迄今發(fā)現(xiàn)的最直接抑制腫瘤發(fā)生的細胞固有成份,二者均定位于染色體9p21不到40Kb的范圍內(nèi)[1]。p16、p15基因對細胞的生長起負性調(diào)控作用,其基因的缺失、突變與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系是目前腫瘤學研究的熱點之一[2]。在既往研究基礎上[3],通過對腫瘤抑制基因p16、p15在國人腦瘤組織中突變頻率的檢測,了解該基因異常與我國腦腫瘤遺傳易感性的關系,并尋找新的篩查腦腫瘤的分子生物學標志。
材料與方法
標本來源和DNA抽提:88例腦腫瘤標本均來自上海華山醫(yī)院,新鮮腫瘤組織43例并取相應手術切端正常組織,近期石蠟包埋標本45例。其中腦膠質(zhì)瘤68例,腦膜瘤5例,聽神經(jīng)瘤5例,垂體瘤3例,髓母細胞瘤2例,血管母細胞瘤2例,腦轉移瘤3例(肺癌轉移2例、乳腺癌轉移1例)。依據(jù)WHO 1993年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準作出腦膠質(zhì)瘤病理分級,包括Ⅰ-Ⅱ級(星形細胞瘤)21例,Ⅲ級(間變型星形細胞瘤)25例,Ⅳ級(膠母細胞瘤)22例。每一標本分二份,一份置液氮中,用于p16、p15基因突變檢測,另一份石蠟包埋用于p16蛋白免疫組化檢測。按常規(guī)方法進行[4]DNA抽提、純化和定量。
, 百拇醫(yī)藥
PCR擴增及條件:PCR反應在PE 9600熱循環(huán)儀中進行,分別擴增p16基因第1、2外顯子和p15基因第2外顯子,引物合成由中科院細胞所完成,各標本并行CDK4的PCR擴增作為內(nèi)參照。p16 CDK4基因的引物序列及擴增條件同前述[3]。p15基因第2外顯子引物序列為(S)CCCGGCCGGCATCTCCCATA,(AS)CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT。
銀染PCR-SSCP分析:各取10μl PCR產(chǎn)物,加入8μl變性緩沖液(80%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯晴藍),96℃變性10min后冰上驟冷,立即上樣行非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳(30∶0.8),10mA恒電流電泳3小時,至溴酚藍接近凝膠底部。取下凝膠,置10%醋酸固定液中30分,再以去離子水漂洗3次(2min/次),加入2%硝酸銀染液染色20分后,去離子水洗膠20秒,凝膠置顯影液(3%無水碳酸鈉,0.2%甲醛,0.02%硫代硫酸鈉)中顯色5~10分,以10%醋酸終止反應,漂洗及分析結果。
, 百拇醫(yī)藥
免疫組化染色:采用ABC免疫組化染色法,按試劑盒說明書進行。P16多克隆抗體購自Pharmingen Inc,生物素標記的羊抗兔IgG、ABC試劑盒均為Vector Lab Inc產(chǎn)品。用正常兔血清作替代對照,PBS作空白對照,正常淋巴細胞作為陽性對照,以細胞核或漿染成棕褐色為陽性。
應用卡方檢驗及精確概率法分析組間差異。
結果
1.腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因改變:本組68例腦膠質(zhì)瘤標本p16、p15基因與內(nèi)對照CDK4基因同步PCR擴增顯示,p16、p15基因擴增陽性者分別為51例、55例,同一樣本的內(nèi)對照CDK4基因擴增均獲成功。擴增陽性標本再經(jīng)銀染PCR-SSCP分析,在p16外顯子1、2及p15外顯子2中,均未見明顯異常移動電泳帶(若DNA片段中殘基發(fā)生突變,將會引起單鏈DNA二級結構改變,SSCP凝膠上出現(xiàn)異常移動電泳帶,即SSCP陽性)。在相應手術切端正常組織未見有基因缺失和突變。
, 百拇醫(yī)藥
2.p16、p15基因缺失、p16蛋白丟失與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關系:見表1,p16、p15基因和p16蛋白的丟失主要見于惡性程度較高Ⅲ-Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤病例中。p16蛋白表達陽性部位見于瘤細胞漿和胞核內(nèi),正常對照細胞核、漿均為陽性,替代對照及空白對照中胞核、胞漿均為陰性。
表1 p16、p15基因缺失、p16蛋白丟失與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關系
病理分級
例數(shù)
P16基因缺失
P15基因缺失
P16蛋白丟失
Ⅰ-Ⅱ
21
, 百拇醫(yī)藥
1(4%)
0
6(28%)
Ⅲ
25
8(32%)
7(28%)
12(48%)
Ⅳ
22
8(36%)
6(27%)
16(72%)
, 百拇醫(yī)藥
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P值為Ⅰ-Ⅱ組與Ⅲ-Ⅳ組間比較
3.非膠質(zhì)細胞腦瘤中p16、p15基因改變及p16蛋白表達:3例腦轉移瘤中2例存在p16基因缺失,1例為肺癌腦轉移,另1例為乳腺癌腦轉移,該2例標本免疫組化檢測均發(fā)現(xiàn)p16蛋白丟失。其余17例非膠質(zhì)細胞性腦瘤中無一例檢測到p16、p15基因的純合性缺失,免疫組化檢測p16蛋白表達均為陽性。所有相應手術切端正常組織未見基因缺失和突變。
討論
腫瘤的發(fā)生與多種基因異常有關,研究這些基因與人群腫瘤易感性關系,對有效防治惡性腫瘤有重要意義。近年來新的腫瘤易感基因不斷被分離鑒定,在腫瘤易感人群中檢測分析新得到的基因、研究其異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系,將有利于尋找鑒定主基因,并可能為腫瘤的早期診斷和治療提供分子標志。新發(fā)現(xiàn)的多腫瘤抑制基因MTS1編碼16Kb的蛋白p16,MTS2編碼14.7Kb的蛋白p15,p15比p16少20個氨基酸殘基,二基因編碼區(qū)核苷酸具有高度的同源性(93%)[1],推測兩蛋白功能相近。p16、p15基因的抑癌機制與細胞周期調(diào)控密切相關,p16、p15蛋白可特異性結合并抑制周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)的活性,使之不能解除Rb基因對轉錄因子的抑制,從而阻止細胞從G1期進入S期而抑制細胞增殖。已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細胞系及一些包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實體瘤組織中存在著p16基因的異常[1,5,6]。
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基因的缺失和突變是導致抑癌基因功能失活的主要原因。在腦膠質(zhì)瘤細胞系檢測中,已發(fā)現(xiàn)p16基因發(fā)生純合性缺失的比例達82%[1],然而,在原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織中該基因缺失的檢出率卻不高[7],本研究68例腦膠質(zhì)瘤中,p16、p15基因缺失主要出現(xiàn)于Ⅲ-Ⅳ級腫瘤(P<0.05,其缺失率分別為34%、28%),這一趨勢在p16蛋白丟失檢測時更加明顯(59%,P<0.05);全部標本銀染PCR-SSCP分析未發(fā)現(xiàn)基因的點突變或小的缺失。這些實驗結果提示腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因改變的主要形式是基因的缺失,突變是極少發(fā)生的。p16、p15基因結構的異常與腦膠質(zhì)瘤瘤變相關,該基因的失活與腦膠質(zhì)瘤的病理分級及其臨床進展更具密切關系,其促進了腫瘤由低病理分級向高病理分級演進的過程。同時,與國外類似研究多數(shù)的報道相比,上述的腫瘤分子生物學改變不具種族特異性[8]。Jen和Tenan認為p16、p15基因是兩個具有獨立功能的基因,可單獨或相加作用于腫瘤演進過程中[6、9],文獻報道p16基因缺失的腫瘤中50%~80%可并有p15基因的缺失,我們的實驗結果支持這一結論,49%(23/47)惡性腦膠質(zhì)瘤存在單純p16或p15基因的缺失,p16基因缺失的標本中p15基因缺失的發(fā)生率為41%(7/16)。
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與腦膠質(zhì)瘤的情況相反,本實驗對17例原發(fā)性非膠質(zhì)細胞腦瘤的檢測無一例發(fā)生p16、p15基因的純合性缺失和突變,p16蛋白的表達均為陽性,表明在腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤、垂體瘤等非膠質(zhì)細胞原發(fā)腦瘤的發(fā)生中,p16、p15基因可能沒有什么作用。然而在3例轉移性腦瘤中卻檢出了2例存在p16基因的純合性缺失并存在蛋白的丟失,分別為肺癌腦轉移和乳腺癌腦轉移。我們知道在同一宿主體內(nèi)發(fā)生的轉移,由于其極端相似的細胞生長條件,轉移瘤的細胞代表了原發(fā)腫瘤的主要細胞克隆,基因改變來源于原發(fā)腫瘤的基因異常[6],Nobori對原發(fā)肺癌p16基因缺失率檢測為36%[10],而乳腺癌細胞株的p16基因缺失率達60%,本實驗對腦轉移瘤的檢測結果間接提示了p16基因與肺癌、乳腺癌的密切關系,更重要的啟示則是p16基因缺失這一腫瘤進展的晚期事件可能與癌的轉移有關,已有學者注意到這一問題,因本組例數(shù)較少,且對照研究不夠,有關這一方面的深入認識尚需進一步探討。由于p16、p15基因的缺失和突變在許多腫瘤細胞系中的檢出率比原發(fā)癌組織高(16),故曾被懷疑是體外建株選擇的結果,現(xiàn)在的研究證實p16基因缺失是多類原發(fā)惡性腫瘤的頻發(fā)事件[2]。癌組織中檢出率低的原因(1)腫瘤內(nèi)間質(zhì)細胞或炎癥細胞的污染;(2)在引物未包括的啟動子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)突變的漏檢;(3)單鏈SSCP技術本身存在的假陰性問題;(4)標本數(shù)目有限?梢酝茰y,應用定量PCR、DNA直接測序等方法學上的改進,將會提高原發(fā)腫瘤組織p16、p15基因異常的檢出率。
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基金項目:國家教委博士點基金資助項目(96026515)
作者簡介:田新華(1965-),男,山西太原人,博士,碩士生導師,副教授,從事神經(jīng)外科專業(yè)。
參考文獻
1,Kamb A,Gruis NA,Weaver-Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994;264:436-438
2,Kyritisis AP,Zhang BH,Zhang W,et al.Mutations of p16 gene in gliomas.Oncogene,1996;12:623-627
3,田新華,江澄川,許凱黎,等.腦膠質(zhì)瘤中MTS1/p16基因的缺失和突變.上海醫(yī)科大學學報,1997;24(S):14-16
, 百拇醫(yī)藥
4,Innis MA,Gelfand DH,Snisky JJ.PCR protocal:a guide to methods and applications.San Diego:Acad press,1990;146-160
5,Nobori T, Kmuira, Wu DJ, et al. Deletion of the cyclin dependent kinase-4 inhibitor gene in multiple human cancer.Nature,1994;386:753-758
6,Jen J,Fouter DS,Swand RE,et al.Deletion of p16 and p15 gene in brain tumors.Cancer Res,1994;54:6353-6358
7,Nishikawa R,Furnair F,Lin H,et al.Homozygous deletions of MTS1/p16 gene in human brain tumors.Cancer Res,1995;55:1941-1943
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8,Walrer DG,Duan W,Popvic EA,et al.Homozygous deletions of the multiple tumor suppressor gene I in the progression of human astrocytomas.Cancer Res,1995;55:20-23
9,Tenan I, Benedeti S, Finochiaro G, et al.Deletion and transfection analysis of the p15/MTS2 gene in malignant gliomas.Biochem Biophysical Research Communication,1995;217:195-202
10,Nobori T,Miura K,Wu DJ,et al.Mutation of p16 ang p15 in human lung cancer.Nature,1995;368:753-756
收稿日期:1999-3-21, 百拇醫(yī)藥
單位:田新華(山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院神經(jīng)外科 太原 030001);江澄川(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科);高翔(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科);許凱黎(上海市腫瘤研究所);周瑾(上海市腫瘤研究所);陳商群(上海華山醫(yī)院神經(jīng)外科)
關鍵詞:腦腫瘤;p16基因;p15基因;基因缺失
中國人腦瘤中p16 〔摘要〕 目的 為了解p16、p15基因與中國人腦腫瘤遺傳易感性的關系。方法 應用PCR、銀染PCR-SSCP及免疫組化法對88例腦腫瘤及相應手術切除正常組織DNA標本p16、p15基因進行研究。結果 結果顯示在不同病理分級腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因缺失率分別為Ⅰ-Ⅱ級4%、0%,Ⅲ級32%、28%,Ⅳ級36%、27%,p16、p15基因缺失主要見于Ⅲ-Ⅳ級腫瘤中;腦轉移瘤中也檢出缺失該基因(2/3),而原發(fā)性非膠質(zhì)細胞瘤(腦膜瘤、垂體瘤、聽神經(jīng)瘤等)中未見p16、p15基因缺失,各類腫瘤標本PCR-SSCP分析均未見p16、p15基因點突變。結論 表明國人腦瘤中p16、p15基因異常以缺失為主,p16、p15基因缺失在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生頻率較高,促進腫瘤細胞由良性向惡性演進,而對良性非膠質(zhì)細胞瘤的發(fā)病沒有作用。
, 百拇醫(yī)藥
〔中圖分類號〕 R739.41 〔文獻標識碼〕B
Analysis on p16、p15gene deletion in human brain tumor in Chinese
TIAN Xin-hua,JIANG Cheng-chuan,XU Kai-li,et al.
Department of Neurosurgery,Huashan Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai 200040
〔Abstract〕 Objective To explore the relationship between p16(MTS1),p15(MTS2) gene and the susceptibility of brain tumor.Methods 88 brain tumor and its neighbouring normal brain tissues at the resection edge were detected using PCR,silver stain PCR-SSCP and immunohistochemistry.Results The deletion rates of p16,p15 gene were 4% and 0% in gliomas of grade Ⅰ-Ⅱ,32% and 28% of grade Ⅲ,36% and 27% of grade Ⅳ respectively.Deletion of p16,p15 gene also occurred in brain metastatic tumors(2/3).But it did not possibly demonstrate deletion of p16,p15 gene in 17 primary non-astrocytic tumors.Mutation of p16,p15 gene was not been found in a variety of brain tumors by PCR-SSCP.Conclusions These data suggest that deletion of p16,p15 gene may be an efficient and commonly seen mechanism of simultaneous inactivation for gliomas,which is associated with the malignant progression of gliomas.On top of this,p16 and p15 gene dose not play a role in the pathogenesis of cerebral non-astrocytic tumors.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 brain tumors;p16 gene;p15 gene;gene deletion
多腫瘤抑制基因(Multiple tumor suppressor,MTS)MTS1/p16、MTS2/p15是迄今發(fā)現(xiàn)的最直接抑制腫瘤發(fā)生的細胞固有成份,二者均定位于染色體9p21不到40Kb的范圍內(nèi)[1]。p16、p15基因對細胞的生長起負性調(diào)控作用,其基因的缺失、突變與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系是目前腫瘤學研究的熱點之一[2]。在既往研究基礎上[3],通過對腫瘤抑制基因p16、p15在國人腦瘤組織中突變頻率的檢測,了解該基因異常與我國腦腫瘤遺傳易感性的關系,并尋找新的篩查腦腫瘤的分子生物學標志。
材料與方法
標本來源和DNA抽提:88例腦腫瘤標本均來自上海華山醫(yī)院,新鮮腫瘤組織43例并取相應手術切端正常組織,近期石蠟包埋標本45例。其中腦膠質(zhì)瘤68例,腦膜瘤5例,聽神經(jīng)瘤5例,垂體瘤3例,髓母細胞瘤2例,血管母細胞瘤2例,腦轉移瘤3例(肺癌轉移2例、乳腺癌轉移1例)。依據(jù)WHO 1993年中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準作出腦膠質(zhì)瘤病理分級,包括Ⅰ-Ⅱ級(星形細胞瘤)21例,Ⅲ級(間變型星形細胞瘤)25例,Ⅳ級(膠母細胞瘤)22例。每一標本分二份,一份置液氮中,用于p16、p15基因突變檢測,另一份石蠟包埋用于p16蛋白免疫組化檢測。按常規(guī)方法進行[4]DNA抽提、純化和定量。
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PCR擴增及條件:PCR反應在PE 9600熱循環(huán)儀中進行,分別擴增p16基因第1、2外顯子和p15基因第2外顯子,引物合成由中科院細胞所完成,各標本并行CDK4的PCR擴增作為內(nèi)參照。p16 CDK4基因的引物序列及擴增條件同前述[3]。p15基因第2外顯子引物序列為(S)CCCGGCCGGCATCTCCCATA,(AS)CGTTGTGGGCGGCTGGGGAACCT。
銀染PCR-SSCP分析:各取10μl PCR產(chǎn)物,加入8μl變性緩沖液(80%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯晴藍),96℃變性10min后冰上驟冷,立即上樣行非變性聚丙稀酰胺凝膠電泳(30∶0.8),10mA恒電流電泳3小時,至溴酚藍接近凝膠底部。取下凝膠,置10%醋酸固定液中30分,再以去離子水漂洗3次(2min/次),加入2%硝酸銀染液染色20分后,去離子水洗膠20秒,凝膠置顯影液(3%無水碳酸鈉,0.2%甲醛,0.02%硫代硫酸鈉)中顯色5~10分,以10%醋酸終止反應,漂洗及分析結果。
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免疫組化染色:采用ABC免疫組化染色法,按試劑盒說明書進行。P16多克隆抗體購自Pharmingen Inc,生物素標記的羊抗兔IgG、ABC試劑盒均為Vector Lab Inc產(chǎn)品。用正常兔血清作替代對照,PBS作空白對照,正常淋巴細胞作為陽性對照,以細胞核或漿染成棕褐色為陽性。
應用卡方檢驗及精確概率法分析組間差異。
結果
1.腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因改變:本組68例腦膠質(zhì)瘤標本p16、p15基因與內(nèi)對照CDK4基因同步PCR擴增顯示,p16、p15基因擴增陽性者分別為51例、55例,同一樣本的內(nèi)對照CDK4基因擴增均獲成功。擴增陽性標本再經(jīng)銀染PCR-SSCP分析,在p16外顯子1、2及p15外顯子2中,均未見明顯異常移動電泳帶(若DNA片段中殘基發(fā)生突變,將會引起單鏈DNA二級結構改變,SSCP凝膠上出現(xiàn)異常移動電泳帶,即SSCP陽性)。在相應手術切端正常組織未見有基因缺失和突變。
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2.p16、p15基因缺失、p16蛋白丟失與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關系:見表1,p16、p15基因和p16蛋白的丟失主要見于惡性程度較高Ⅲ-Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤病例中。p16蛋白表達陽性部位見于瘤細胞漿和胞核內(nèi),正常對照細胞核、漿均為陽性,替代對照及空白對照中胞核、胞漿均為陰性。
表1 p16、p15基因缺失、p16蛋白丟失與腦膠質(zhì)瘤病理分級的關系
病理分級
例數(shù)
P16基因缺失
P15基因缺失
P16蛋白丟失
Ⅰ-Ⅱ
21
, 百拇醫(yī)藥
1(4%)
0
6(28%)
Ⅲ
25
8(32%)
7(28%)
12(48%)
Ⅳ
22
8(36%)
6(27%)
16(72%)
, 百拇醫(yī)藥
P<0.05
P<0.05
P<0.01
P值為Ⅰ-Ⅱ組與Ⅲ-Ⅳ組間比較
3.非膠質(zhì)細胞腦瘤中p16、p15基因改變及p16蛋白表達:3例腦轉移瘤中2例存在p16基因缺失,1例為肺癌腦轉移,另1例為乳腺癌腦轉移,該2例標本免疫組化檢測均發(fā)現(xiàn)p16蛋白丟失。其余17例非膠質(zhì)細胞性腦瘤中無一例檢測到p16、p15基因的純合性缺失,免疫組化檢測p16蛋白表達均為陽性。所有相應手術切端正常組織未見基因缺失和突變。
討論
腫瘤的發(fā)生與多種基因異常有關,研究這些基因與人群腫瘤易感性關系,對有效防治惡性腫瘤有重要意義。近年來新的腫瘤易感基因不斷被分離鑒定,在腫瘤易感人群中檢測分析新得到的基因、研究其異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系,將有利于尋找鑒定主基因,并可能為腫瘤的早期診斷和治療提供分子標志。新發(fā)現(xiàn)的多腫瘤抑制基因MTS1編碼16Kb的蛋白p16,MTS2編碼14.7Kb的蛋白p15,p15比p16少20個氨基酸殘基,二基因編碼區(qū)核苷酸具有高度的同源性(93%)[1],推測兩蛋白功能相近。p16、p15基因的抑癌機制與細胞周期調(diào)控密切相關,p16、p15蛋白可特異性結合并抑制周期素依賴性蛋白激酶4(CDK4)的活性,使之不能解除Rb基因對轉錄因子的抑制,從而阻止細胞從G1期進入S期而抑制細胞增殖。已發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤細胞系及一些包括腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的實體瘤組織中存在著p16基因的異常[1,5,6]。
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基因的缺失和突變是導致抑癌基因功能失活的主要原因。在腦膠質(zhì)瘤細胞系檢測中,已發(fā)現(xiàn)p16基因發(fā)生純合性缺失的比例達82%[1],然而,在原發(fā)性腦膠質(zhì)瘤組織中該基因缺失的檢出率卻不高[7],本研究68例腦膠質(zhì)瘤中,p16、p15基因缺失主要出現(xiàn)于Ⅲ-Ⅳ級腫瘤(P<0.05,其缺失率分別為34%、28%),這一趨勢在p16蛋白丟失檢測時更加明顯(59%,P<0.05);全部標本銀染PCR-SSCP分析未發(fā)現(xiàn)基因的點突變或小的缺失。這些實驗結果提示腦膠質(zhì)瘤中p16、p15基因改變的主要形式是基因的缺失,突變是極少發(fā)生的。p16、p15基因結構的異常與腦膠質(zhì)瘤瘤變相關,該基因的失活與腦膠質(zhì)瘤的病理分級及其臨床進展更具密切關系,其促進了腫瘤由低病理分級向高病理分級演進的過程。同時,與國外類似研究多數(shù)的報道相比,上述的腫瘤分子生物學改變不具種族特異性[8]。Jen和Tenan認為p16、p15基因是兩個具有獨立功能的基因,可單獨或相加作用于腫瘤演進過程中[6、9],文獻報道p16基因缺失的腫瘤中50%~80%可并有p15基因的缺失,我們的實驗結果支持這一結論,49%(23/47)惡性腦膠質(zhì)瘤存在單純p16或p15基因的缺失,p16基因缺失的標本中p15基因缺失的發(fā)生率為41%(7/16)。
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與腦膠質(zhì)瘤的情況相反,本實驗對17例原發(fā)性非膠質(zhì)細胞腦瘤的檢測無一例發(fā)生p16、p15基因的純合性缺失和突變,p16蛋白的表達均為陽性,表明在腦膜瘤、聽神經(jīng)瘤、垂體瘤等非膠質(zhì)細胞原發(fā)腦瘤的發(fā)生中,p16、p15基因可能沒有什么作用。然而在3例轉移性腦瘤中卻檢出了2例存在p16基因的純合性缺失并存在蛋白的丟失,分別為肺癌腦轉移和乳腺癌腦轉移。我們知道在同一宿主體內(nèi)發(fā)生的轉移,由于其極端相似的細胞生長條件,轉移瘤的細胞代表了原發(fā)腫瘤的主要細胞克隆,基因改變來源于原發(fā)腫瘤的基因異常[6],Nobori對原發(fā)肺癌p16基因缺失率檢測為36%[10],而乳腺癌細胞株的p16基因缺失率達60%,本實驗對腦轉移瘤的檢測結果間接提示了p16基因與肺癌、乳腺癌的密切關系,更重要的啟示則是p16基因缺失這一腫瘤進展的晚期事件可能與癌的轉移有關,已有學者注意到這一問題,因本組例數(shù)較少,且對照研究不夠,有關這一方面的深入認識尚需進一步探討。由于p16、p15基因的缺失和突變在許多腫瘤細胞系中的檢出率比原發(fā)癌組織高(16),故曾被懷疑是體外建株選擇的結果,現(xiàn)在的研究證實p16基因缺失是多類原發(fā)惡性腫瘤的頻發(fā)事件[2]。癌組織中檢出率低的原因(1)腫瘤內(nèi)間質(zhì)細胞或炎癥細胞的污染;(2)在引物未包括的啟動子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)突變的漏檢;(3)單鏈SSCP技術本身存在的假陰性問題;(4)標本數(shù)目有限?梢酝茰y,應用定量PCR、DNA直接測序等方法學上的改進,將會提高原發(fā)腫瘤組織p16、p15基因異常的檢出率。
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基金項目:國家教委博士點基金資助項目(96026515)
作者簡介:田新華(1965-),男,山西太原人,博士,碩士生導師,副教授,從事神經(jīng)外科專業(yè)。
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收稿日期:1999-3-21, 百拇醫(yī)藥