P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)及其與骨肉瘤預(yù)后的關(guān)系
作者：谷貴山 徐莘香
單位：谷貴山(白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院骨科 長春 130021)；徐莘香(白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院骨科 長春 130021)
關(guān)鍵詞：骨肉瘤；基因；免疫組化
P 〔摘要〕 目的 探討P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。方法 15例骨肉瘤和5例軟骨肉瘤石蠟切片，應(yīng)用S-P免疫組化染色，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果 15例骨肉瘤P-170的陽性率為33.33%，GST的陽性率為80%，TOPO-Ⅱ的陽性率為46.67%，nm23和CD44的陽性率分別為93.33%、86.67%。年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170、TOPO-Ⅱ、CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組(P<0.05)。GST的表達(dá)率在兩組無差異。術(shù)前化療組P-170 CD44 nm23的陽性率高于術(shù)前無化療組，而TOPO-Ⅱ GST在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組(P<0.05)。存活在2年以內(nèi)者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的陽性率比存活兩年以上者高，而nm23、CD44的表達(dá)情況正相反(P<0.05)。P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)率均高于軟骨肉瘤(P<0.05)。結(jié)論 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)率明顯高于軟骨肉瘤。在骨肉瘤中P-170、GST、TOPO-Ⅱ聯(lián)合表達(dá)率越高，病人生存期越短。在臨床上可聯(lián)合檢測，以此對骨肉瘤的惡性程度及預(yù)后進(jìn)行評估。
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〔中圖分類號〕 R738.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕B
Expression of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23,CD44 in osteosarcoma and its correlation with prognosis
GU Gui-shan,XU Xin-xiang
(Department of Orthopeadics,First Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
〔Abstract〕 Objective The expression of P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44 in osteosarcoma was analyzed for approaching the relationship between the expression of the above 5 proteins and prognosis.Methods 18cases of human osteosarcoma and 5 cases of chondrosarcoma were studied by the methods of immunohistochemical assay.Results In osteosarcoma the positive rate was 33.3% for P-170,80% for GST and 46.67% for TOPO-Ⅱ、 93.33% for nm23,and 86.67% for CD44.But in chondrosarcoma the positive rate of P-170 was 0, of GST was 20%,of TOPO-Ⅱ was 20%,of CD44 and nm23 was 20% and 0 respectively.The positive rates of P-170,TOPO-Ⅱ and CD44 in the group with the age of less than 20 were higher than those in the group of older than 20.P-170,CD44,nm23 more highly expressed in the group of preoperative chemotherapy than in the group of no-preoperative chemotherapy.The patients survived for no more than 2 years had higher expressions of P-170、GST、TOPO-Ⅱ.Conclusions Detection of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23 and CD44 together can evaluate the malignance and prognosis of osteosarcoma,which should be used in clinic to instruct the treatment of osteosarcom.
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〔Key words〕 osteosarcoma; gene; immunohistochemistry
影響骨肉瘤預(yù)后的因素眾多，這些因素既獨(dú)立影響又相互關(guān)聯(lián)，以單因素指標(biāo)預(yù)測預(yù)后，往往造成較大的偏差。經(jīng)多年研究，學(xué)者們認(rèn)為影響骨肉瘤預(yù)后的根本原因在于：腫瘤細(xì)胞的增殖能力，轉(zhuǎn)移能力以及對化療藥物的耐藥能力。本文根據(jù)骨肉瘤相關(guān)基因的不同特性，選擇與轉(zhuǎn)移及多藥耐有關(guān)的nm23、CD44、P-170、GST、TOPO-Ⅱ基因，應(yīng)用免疫組化方法檢測五種蛋白在骨肉瘤的表達(dá)，旨在尋找合理搭配的骨肉瘤預(yù)后標(biāo)志物并評價(jià)其可靠性。
材料與方法
一、標(biāo)本來源 本次實(shí)驗(yàn)共選用15例骨肉瘤，其中包括骨母細(xì)胞性6例，纖維母細(xì)胞性5例，軟骨母細(xì)胞性4例，和5例軟骨肉瘤標(biāo)本，均取自我院病理科，并經(jīng)病理專家重新進(jìn)行診斷，所有標(biāo)本均為手術(shù)后經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后切片。行5um連續(xù)切片六張，分別進(jìn)行HE染色，P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44染色。
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二、臨床資料 15例骨肉瘤患者，男7例，女8例。年齡：11～67歲。股骨下端8例，脛骨上端5例，肱骨上端、肋骨各1例。術(shù)前化療7例，術(shù)后化療11例。術(shù)前術(shù)后均行化療5例，存活不足兩年者10例，兩年以上者5例。
三、主要試劑 P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44基因蛋白，S-P免疫組化、二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色試劑盒均購于福州Maxim生物技術(shù)開發(fā)公司。
四、免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟，水化，PBS(PH7.4)沖洗。過氧化酶(試劑A)阻斷15分鐘，室溫下10%山羊血清(試劑B)封閉非特異性背景15分鐘， 加入一抗(P-170、 GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44單克隆抗體)，4℃冰箱過夜。取出后PBS沖洗，加入生物素標(biāo)記的二抗(試劑C)，室溫孵育30分鐘，PBS(PH7.4)沖洗。鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液(試劑D)室溫孵育30分鐘，PBS(PH7.4)沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。
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五、結(jié)果判定 判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)無著色細(xì)胞或與背景一致；陽性(+)著色細(xì)胞均呈棕黃色。
六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用X2檢驗(yàn)
結(jié)果
15例骨肉瘤P-170的陽性率為33.33%，GST的陽性率為80%，TOPO-Ⅱ的陽性率為46.67%， nm23和CD44的陽性率分別為93.33%，86.67%。根據(jù)年齡、化療情況、存活時(shí)間進(jìn)行分組(見表1，2，3，4)。
表1 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與年齡的關(guān)系
基因蛋白
年齡小于20歲
(10例)
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陽性率(%)
年齡大于20歲
(5例)
陽性率(%)
P-170
50%(5/10)
0%(0/5)
GST
80%(8/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
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40%(2/5)
CD44
100%(10/10)
60%(3/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表2 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與化療的關(guān)系
基因蛋白
術(shù)前化療組
(7例)
, http://www.www.srpcoatings.com 陽性率(%)
術(shù)前無化療組
(8例)
陽性率(%)
P-170
57.1%(4/7)
12.5%(1/8)
GST
71.43%(5/7)
87.5%(7/8)
TOPO-Ⅱ
42.86%(3/7)
, 百拇醫(yī)藥
50%(4/8)
CD44
100%(7/7)
75%(6/8)
nm23
100%(7/7)
87.5%(7/8)
表3 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與存活的關(guān)系
基因蛋白
存活2年以內(nèi)組
(10例)
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陽性率(%)
存活2年以上組
(含2年，5例)
陽性率(%)
P-170
40%(4/10)
20%(1/5)
GST
90%(9/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
, 百拇醫(yī)藥
40%(2/5)
CD44
80%(8/10)
100%(5/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表4 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤及軟骨肉瘤的表達(dá)
基因蛋白
骨肉瘤
(15例)
, 百拇醫(yī)藥 陽性率(%)
軟骨肉瘤
(5例)
陽性率(%)
P-170
33.33%(5/15)
0%(0/5)
GST
80%(12/15)
20%(1/5)
TOPO-Ⅱ
46.67%(6/15)
, 百拇醫(yī)藥
0%(0/5)
CD44
86.67%(13/15)
0%(0/5)
nm23
93.33%(14/15)
20%(1/5)
年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170 TOPO-Ⅱ CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組(P<0.05)，GST的表達(dá)率在兩組無差異。
術(shù)前化療組P-170 CD44 nm23的陽性率高于術(shù)前無化療組，而TOPO-Ⅱ、GST在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組(P<0.05)。
, 百拇醫(yī)藥
存活在2年以內(nèi)者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的陽性率比存活兩年以上者高，而nm23，CD44的表達(dá)情況正相反(P<0.05)。
P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44在骨肉瘤的表達(dá)率均高于軟骨肉瘤(P<0.05)。
討論
腫瘤細(xì)胞的增殖能力、轉(zhuǎn)移能力、及對化療藥物的敏感性是影響骨肉瘤預(yù)后的根本原因。這些因素既獨(dú)立又相互關(guān)聯(lián)。因此，選擇綜合指標(biāo)來判斷預(yù)后顯得非常重要。P-170蛋白[1](P-glycoprotein P-gp)是多藥耐藥基因(MDR1)的表達(dá)產(chǎn)物，是一種膜糖蛋白，分子量為170KD，它與某些細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有同源基因序列。它是一種ATP依賴的藥物外流泵，P-糖蛋白的增加會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物總量的減少，從而阻礙化療藥物的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，影響化療的療效，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生典型多藥耐藥的主要原因。人體多種器官的正常細(xì)胞，例如：腎上腺、腎臟、肝臟、結(jié)腸等都有較高的P-170蛋白的表達(dá)，在這些組織發(fā)生的腫瘤例如：嗜鉻細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等也有相應(yīng)的高表達(dá)。1993年，Ulrike stein等應(yīng)用Northern雜交及免疫組化技術(shù)對29例骨組織和32例軟組織腫瘤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：69%表現(xiàn)為MDR1及P-170的陽性表達(dá)，這其中骨肉瘤為高表達(dá)，其表達(dá)率高達(dá)90%，惡纖組為低表達(dá)，其余均為中等程度表達(dá)。
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GST[2-4]即谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶，包括谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶，是人體正常代謝所需的酶，谷胱甘肽和谷胱甘肽代謝酶的增加，使腫瘤細(xì)胞的解毒能力增加，嚴(yán)重影響了化療藥物對腫瘤的殺傷作用，是骨肉瘤產(chǎn)生多藥耐藥的另一主要原因，1991年，Brian等研究發(fā)現(xiàn)在對阿霉素耐藥的人骨與軟組織肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯增高，超出非耐藥細(xì)胞的3.5～6倍，1986年，Gerald等發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌耐藥細(xì)胞中存在谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)。
TOPO-Ⅱ[5-6]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是許多抗癌藥物的靶酶，耐藥細(xì)胞通過不同環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)其酶的表達(dá)量及活性，維持耐藥表型。TOPO-Ⅱ是一種核酸酶，它的作用是影響細(xì)胞DNA的合成，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA松弛、解旋、斷裂和重接，它的高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞復(fù)制加快，增加腫瘤的惡性程度。
nm23[7-12]腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是1988年由美國國家癌癥研究院的Steeg等首先發(fā)現(xiàn)的，它在人類腫瘤如腎癌，肺癌，結(jié)腸癌等的組織中的表達(dá)與預(yù)后或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，目前被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的最佳代表。Bevilacqua等研究顯示，具有高度轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌伴有低水平的nm23的表達(dá)，由此認(rèn)為nm23基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，這一理論被以后的實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)。在骨肉瘤中，學(xué)者們卻有相反的發(fā)現(xiàn)，1995年Oda等應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究了41例骨肉瘤和22例骨軟骨瘤的nm23表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)nm23的表達(dá)與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能并沒有相關(guān)關(guān)系。
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CD44[13]是分布極廣的細(xì)胞表面跨膜蛋白，它既是細(xì)胞表面的黏附分子同時(shí)又充當(dāng)表面受體的作用，研究表明：它與某些腺癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。1996年Jamal在研究CD44v基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)CD44在成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，然而表達(dá)的類型僅為CD44s，而不是與轉(zhuǎn)移有關(guān)的CD44v。我們的研究發(fā)現(xiàn)：上述五種基因蛋白在骨肉瘤的陽性表達(dá)率均明顯高于軟骨肉瘤，眾所周知，骨肉瘤的惡性程度要高于軟骨肉瘤，因此，我們認(rèn)為P-170，GST，TOPO-Ⅱ，CD44，nm23的高表達(dá)與骨肉瘤的惡性度有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，P-170，GST，TOPO-Ⅱ表達(dá)陽性率越高，病人的生存時(shí)間越短，原因在于P-170，GST，TOPO-Ⅱ的聯(lián)合表達(dá)顯示，腫瘤細(xì)胞既存在典型的多藥耐藥又存在非典型多藥耐藥，耐藥的發(fā)生導(dǎo)致在骨肉瘤治療中起重要作用的化療的失敗，從而嚴(yán)重影響了骨肉瘤患者的生存率。另外，從五種基因表達(dá)與年齡的關(guān)系看，年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組，GST的表達(dá)率在兩組無差異。骨肉瘤的惡性程度與年齡有關(guān)，年齡越小，惡性程度越高，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的陽性率高于高年齡組，這從另一角度顯示三者與骨肉瘤惡性度有關(guān)。理論上認(rèn)為化療后P-170，TOPO-Ⅱ，GST均應(yīng)高于化療前，但此研究中僅P-170蛋白的表達(dá)率高于化療前，而TOPO-Ⅱ GST 在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組。這表明骨肉瘤發(fā)生多藥耐藥常常以典型多藥耐藥出現(xiàn)。
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因此，臨床上可以聯(lián)合P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44特別是P-170，GST，TOPO-Ⅱ的表達(dá)情況來判斷骨肉瘤惡性程度及對預(yù)后進(jìn)行評估，在指導(dǎo)治療，例如化療方案的設(shè)計(jì)等方面，聯(lián)合檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
基金項(xiàng)目：吉林省科委基金資助項(xiàng)目(970329)
作者簡介：谷貴山(1965-)，男，吉林省人，博士，副教授。從事骨科、骨腫瘤專業(yè)。
參考文獻(xiàn)
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收稿日期：1999-5-31, http://www.www.srpcoatings.com
單位：谷貴山(白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院骨科 長春 130021)；徐莘香(白求恩醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院骨科 長春 130021)
關(guān)鍵詞：骨肉瘤；基因；免疫組化
P 〔摘要〕 目的 探討P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系。方法 15例骨肉瘤和5例軟骨肉瘤石蠟切片，應(yīng)用S-P免疫組化染色，結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果 15例骨肉瘤P-170的陽性率為33.33%，GST的陽性率為80%，TOPO-Ⅱ的陽性率為46.67%，nm23和CD44的陽性率分別為93.33%、86.67%。年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170、TOPO-Ⅱ、CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組(P<0.05)。GST的表達(dá)率在兩組無差異。術(shù)前化療組P-170 CD44 nm23的陽性率高于術(shù)前無化療組，而TOPO-Ⅱ GST在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組(P<0.05)。存活在2年以內(nèi)者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的陽性率比存活兩年以上者高，而nm23、CD44的表達(dá)情況正相反(P<0.05)。P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)率均高于軟骨肉瘤(P<0.05)。結(jié)論 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤的表達(dá)率明顯高于軟骨肉瘤。在骨肉瘤中P-170、GST、TOPO-Ⅱ聯(lián)合表達(dá)率越高，病人生存期越短。在臨床上可聯(lián)合檢測，以此對骨肉瘤的惡性程度及預(yù)后進(jìn)行評估。
, http://www.www.srpcoatings.com
〔中圖分類號〕 R738.1 〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕B
Expression of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23,CD44 in osteosarcoma and its correlation with prognosis
GU Gui-shan,XU Xin-xiang
(Department of Orthopeadics,First Clinical College of Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
〔Abstract〕 Objective The expression of P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44 in osteosarcoma was analyzed for approaching the relationship between the expression of the above 5 proteins and prognosis.Methods 18cases of human osteosarcoma and 5 cases of chondrosarcoma were studied by the methods of immunohistochemical assay.Results In osteosarcoma the positive rate was 33.3% for P-170,80% for GST and 46.67% for TOPO-Ⅱ、 93.33% for nm23,and 86.67% for CD44.But in chondrosarcoma the positive rate of P-170 was 0, of GST was 20%,of TOPO-Ⅱ was 20%,of CD44 and nm23 was 20% and 0 respectively.The positive rates of P-170,TOPO-Ⅱ and CD44 in the group with the age of less than 20 were higher than those in the group of older than 20.P-170,CD44,nm23 more highly expressed in the group of preoperative chemotherapy than in the group of no-preoperative chemotherapy.The patients survived for no more than 2 years had higher expressions of P-170、GST、TOPO-Ⅱ.Conclusions Detection of P-170,GST,TOPO-Ⅱ,nm23 and CD44 together can evaluate the malignance and prognosis of osteosarcoma,which should be used in clinic to instruct the treatment of osteosarcom.
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〔Key words〕 osteosarcoma; gene; immunohistochemistry
影響骨肉瘤預(yù)后的因素眾多，這些因素既獨(dú)立影響又相互關(guān)聯(lián)，以單因素指標(biāo)預(yù)測預(yù)后，往往造成較大的偏差。經(jīng)多年研究，學(xué)者們認(rèn)為影響骨肉瘤預(yù)后的根本原因在于：腫瘤細(xì)胞的增殖能力，轉(zhuǎn)移能力以及對化療藥物的耐藥能力。本文根據(jù)骨肉瘤相關(guān)基因的不同特性，選擇與轉(zhuǎn)移及多藥耐有關(guān)的nm23、CD44、P-170、GST、TOPO-Ⅱ基因，應(yīng)用免疫組化方法檢測五種蛋白在骨肉瘤的表達(dá)，旨在尋找合理搭配的骨肉瘤預(yù)后標(biāo)志物并評價(jià)其可靠性。
材料與方法
一、標(biāo)本來源 本次實(shí)驗(yàn)共選用15例骨肉瘤，其中包括骨母細(xì)胞性6例，纖維母細(xì)胞性5例，軟骨母細(xì)胞性4例，和5例軟骨肉瘤標(biāo)本，均取自我院病理科，并經(jīng)病理專家重新進(jìn)行診斷，所有標(biāo)本均為手術(shù)后經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋后切片。行5um連續(xù)切片六張，分別進(jìn)行HE染色，P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44染色。
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二、臨床資料 15例骨肉瘤患者，男7例，女8例。年齡：11～67歲。股骨下端8例，脛骨上端5例，肱骨上端、肋骨各1例。術(shù)前化療7例，術(shù)后化療11例。術(shù)前術(shù)后均行化療5例，存活不足兩年者10例，兩年以上者5例。
三、主要試劑 P-170、GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44基因蛋白，S-P免疫組化、二氨基聯(lián)苯胺(DBA)顯色試劑盒均購于福州Maxim生物技術(shù)開發(fā)公司。
四、免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟，水化，PBS(PH7.4)沖洗。過氧化酶(試劑A)阻斷15分鐘，室溫下10%山羊血清(試劑B)封閉非特異性背景15分鐘， 加入一抗(P-170、 GST、TOPO-Ⅱ nm23、CD44單克隆抗體)，4℃冰箱過夜。取出后PBS沖洗，加入生物素標(biāo)記的二抗(試劑C)，室溫孵育30分鐘，PBS(PH7.4)沖洗。鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶溶液(試劑D)室溫孵育30分鐘，PBS(PH7.4)沖洗，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。
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五、結(jié)果判定 判定標(biāo)準(zhǔn)：陰性(-)無著色細(xì)胞或與背景一致；陽性(+)著色細(xì)胞均呈棕黃色。
六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用X2檢驗(yàn)
結(jié)果
15例骨肉瘤P-170的陽性率為33.33%，GST的陽性率為80%，TOPO-Ⅱ的陽性率為46.67%， nm23和CD44的陽性率分別為93.33%，86.67%。根據(jù)年齡、化療情況、存活時(shí)間進(jìn)行分組(見表1，2，3，4)。
表1 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與年齡的關(guān)系
基因蛋白
年齡小于20歲
(10例)
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陽性率(%)
年齡大于20歲
(5例)
陽性率(%)
P-170
50%(5/10)
0%(0/5)
GST
80%(8/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
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40%(2/5)
CD44
100%(10/10)
60%(3/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表2 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與化療的關(guān)系
基因蛋白
術(shù)前化療組
(7例)
, http://www.www.srpcoatings.com 陽性率(%)
術(shù)前無化療組
(8例)
陽性率(%)
P-170
57.1%(4/7)
12.5%(1/8)
GST
71.43%(5/7)
87.5%(7/8)
TOPO-Ⅱ
42.86%(3/7)
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50%(4/8)
CD44
100%(7/7)
75%(6/8)
nm23
100%(7/7)
87.5%(7/8)
表3 骨肉瘤P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44的表達(dá)與存活的關(guān)系
基因蛋白
存活2年以內(nèi)組
(10例)
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陽性率(%)
存活2年以上組
(含2年，5例)
陽性率(%)
P-170
40%(4/10)
20%(1/5)
GST
90%(9/10)
80%(4/5)
TOPO-Ⅱ
50%(5/10)
, 百拇醫(yī)藥
40%(2/5)
CD44
80%(8/10)
100%(5/5)
nm23
90%(9/10)
100%(5/5)
表4 P-170、GST、TOPO-Ⅱ、nm23、CD44在骨肉瘤及軟骨肉瘤的表達(dá)
基因蛋白
骨肉瘤
(15例)
, 百拇醫(yī)藥 陽性率(%)
軟骨肉瘤
(5例)
陽性率(%)
P-170
33.33%(5/15)
0%(0/5)
GST
80%(12/15)
20%(1/5)
TOPO-Ⅱ
46.67%(6/15)
, 百拇醫(yī)藥
0%(0/5)
CD44
86.67%(13/15)
0%(0/5)
nm23
93.33%(14/15)
20%(1/5)
年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170 TOPO-Ⅱ CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組(P<0.05)，GST的表達(dá)率在兩組無差異。
術(shù)前化療組P-170 CD44 nm23的陽性率高于術(shù)前無化療組，而TOPO-Ⅱ、GST在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組(P<0.05)。
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存活在2年以內(nèi)者P-170，GST，TOPO-Ⅱ的陽性率比存活兩年以上者高，而nm23，CD44的表達(dá)情況正相反(P<0.05)。
P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44在骨肉瘤的表達(dá)率均高于軟骨肉瘤(P<0.05)。
討論
腫瘤細(xì)胞的增殖能力、轉(zhuǎn)移能力、及對化療藥物的敏感性是影響骨肉瘤預(yù)后的根本原因。這些因素既獨(dú)立又相互關(guān)聯(lián)。因此，選擇綜合指標(biāo)來判斷預(yù)后顯得非常重要。P-170蛋白[1](P-glycoprotein P-gp)是多藥耐藥基因(MDR1)的表達(dá)產(chǎn)物，是一種膜糖蛋白，分子量為170KD，它與某些細(xì)菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有同源基因序列。它是一種ATP依賴的藥物外流泵，P-糖蛋白的增加會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)化療藥物總量的減少，從而阻礙化療藥物的腫瘤細(xì)胞殺傷作用，影響化療的療效，是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生典型多藥耐藥的主要原因。人體多種器官的正常細(xì)胞，例如：腎上腺、腎臟、肝臟、結(jié)腸等都有較高的P-170蛋白的表達(dá)，在這些組織發(fā)生的腫瘤例如：嗜鉻細(xì)胞瘤、結(jié)腸癌、腎細(xì)胞癌等也有相應(yīng)的高表達(dá)。1993年，Ulrike stein等應(yīng)用Northern雜交及免疫組化技術(shù)對29例骨組織和32例軟組織腫瘤進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：69%表現(xiàn)為MDR1及P-170的陽性表達(dá)，這其中骨肉瘤為高表達(dá)，其表達(dá)率高達(dá)90%，惡纖組為低表達(dá)，其余均為中等程度表達(dá)。
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GST[2-4]即谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶，包括谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶，是人體正常代謝所需的酶，谷胱甘肽和谷胱甘肽代謝酶的增加，使腫瘤細(xì)胞的解毒能力增加，嚴(yán)重影響了化療藥物對腫瘤的殺傷作用，是骨肉瘤產(chǎn)生多藥耐藥的另一主要原因，1991年，Brian等研究發(fā)現(xiàn)在對阿霉素耐藥的人骨與軟組織肉瘤細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)，谷胱甘肽過氧化物酶活性明顯增高，超出非耐藥細(xì)胞的3.5～6倍，1986年，Gerald等發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌耐藥細(xì)胞中存在谷胱甘肽-巰基轉(zhuǎn)移酶的高表達(dá)。
TOPO-Ⅱ[5-6]DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ是許多抗癌藥物的靶酶，耐藥細(xì)胞通過不同環(huán)節(jié)調(diào)節(jié)其酶的表達(dá)量及活性，維持耐藥表型。TOPO-Ⅱ是一種核酸酶，它的作用是影響細(xì)胞DNA的合成，它可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞DNA松弛、解旋、斷裂和重接，它的高表達(dá)使腫瘤細(xì)胞復(fù)制加快，增加腫瘤的惡性程度。
nm23[7-12]腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因是1988年由美國國家癌癥研究院的Steeg等首先發(fā)現(xiàn)的，它在人類腫瘤如腎癌，肺癌，結(jié)腸癌等的組織中的表達(dá)與預(yù)后或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，目前被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因的最佳代表。Bevilacqua等研究顯示，具有高度轉(zhuǎn)移性的人乳腺癌伴有低水平的nm23的表達(dá)，由此認(rèn)為nm23基因表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移潛能呈負(fù)相關(guān)，這一理論被以后的實(shí)驗(yàn)相繼證實(shí)。在骨肉瘤中，學(xué)者們卻有相反的發(fā)現(xiàn)，1995年Oda等應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究了41例骨肉瘤和22例骨軟骨瘤的nm23表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)nm23的表達(dá)與骨肉瘤的轉(zhuǎn)移潛能并沒有相關(guān)關(guān)系。
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CD44[13]是分布極廣的細(xì)胞表面跨膜蛋白，它既是細(xì)胞表面的黏附分子同時(shí)又充當(dāng)表面受體的作用，研究表明：它與某些腺癌轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。1996年Jamal在研究CD44v基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)CD44在成骨細(xì)胞，骨細(xì)胞以及體外培養(yǎng)的骨肉瘤細(xì)胞中均有表達(dá)，然而表達(dá)的類型僅為CD44s，而不是與轉(zhuǎn)移有關(guān)的CD44v。我們的研究發(fā)現(xiàn)：上述五種基因蛋白在骨肉瘤的陽性表達(dá)率均明顯高于軟骨肉瘤，眾所周知，骨肉瘤的惡性程度要高于軟骨肉瘤，因此，我們認(rèn)為P-170，GST，TOPO-Ⅱ，CD44，nm23的高表達(dá)與骨肉瘤的惡性度有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，P-170，GST，TOPO-Ⅱ表達(dá)陽性率越高，病人的生存時(shí)間越短，原因在于P-170，GST，TOPO-Ⅱ的聯(lián)合表達(dá)顯示，腫瘤細(xì)胞既存在典型的多藥耐藥又存在非典型多藥耐藥，耐藥的發(fā)生導(dǎo)致在骨肉瘤治療中起重要作用的化療的失敗，從而嚴(yán)重影響了骨肉瘤患者的生存率。另外，從五種基因表達(dá)與年齡的關(guān)系看，年齡小于20歲的骨肉瘤患者組，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的陽性率均高于年齡大于20歲組，而nm23在小于20歲組的陽性率卻低于大于20歲組，GST的表達(dá)率在兩組無差異。骨肉瘤的惡性程度與年齡有關(guān)，年齡越小，惡性程度越高，P-170，TOPO-Ⅱ，CD44的陽性率高于高年齡組，這從另一角度顯示三者與骨肉瘤惡性度有關(guān)。理論上認(rèn)為化療后P-170，TOPO-Ⅱ，GST均應(yīng)高于化療前，但此研究中僅P-170蛋白的表達(dá)率高于化療前，而TOPO-Ⅱ GST 在術(shù)前化療組的表達(dá)卻低于術(shù)前無化療組。這表明骨肉瘤發(fā)生多藥耐藥常常以典型多藥耐藥出現(xiàn)。
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因此，臨床上可以聯(lián)合P-170，GST，TOPO-Ⅱ，nm23，CD44特別是P-170，GST，TOPO-Ⅱ的表達(dá)情況來判斷骨肉瘤惡性程度及對預(yù)后進(jìn)行評估，在指導(dǎo)治療，例如化療方案的設(shè)計(jì)等方面，聯(lián)合檢測具有重要的臨床指導(dǎo)意義。
基金項(xiàng)目：吉林省科委基金資助項(xiàng)目(970329)
作者簡介：谷貴山(1965-)，男，吉林省人，博士，副教授。從事骨科、骨腫瘤專業(yè)。
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收稿日期：1999-5-31, http://www.www.srpcoatings.com