應(yīng)用巢式RT-PCR檢測原發(fā)性肝細胞癌患者外周血中的微轉(zhuǎn)移
作者：周京旭 楊希山 袁愛力 林金容 林鴻 賴卓勝 黃宇琦
單位：周京旭(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；楊希山(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；袁愛力(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；林金容(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；林鴻(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；賴卓勝(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；黃宇琦(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)
關(guān)鍵詞：原發(fā)性肝細胞癌；甲胎蛋白；微轉(zhuǎn)移；巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR
應(yīng)用巢式RT 〔摘要〕 目的 以AFPmRNA為標志基因，檢測原發(fā)性肝細胞癌患者外周血中微轉(zhuǎn)移情況。方法 應(yīng)用巢式RT-PCR方法，檢測71例肝細胞癌、21例肝硬化患者、28例健康對照、4例轉(zhuǎn)移性肝癌、4例肝膿腫、4例肝血管瘤及5例其它惡性腫瘤患者外周血中AFPmRNA的表達。結(jié)果 71例肝癌患者中，AFPmRNA陽性39例，陽性率為54.9%，其中8例有遠處轉(zhuǎn)移的全部陽性(100%)，未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移者陽性31例，陽性率為49.2%。21例肝硬化患者中僅2例陽性，而轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝膿腫、其它惡性腫瘤、健康對照均為陰性。結(jié)論 檢測肝細胞癌患者外周血中的AFPmRNA，是一種早期發(fā)現(xiàn)肝細胞癌血道播散的靈敏方法。
, http://www.www.srpcoatings.com
〔中圖分類號〕 R735.7；R730.43 〔文獻標識碼〕B
Detection of peripheral blood micrometastasis in patients with hepatocellular carcinoma by nested RT-PCR
ZHOU Jing-xu,YANG Xi-shan,YUAN Ai-li,et al.
(PLA Institute for Digestive Diseases,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
〔Abstract〕 Objective To detect hepatocyte-associated gene AFPmRNA to demonstrate micrometastasis in peripheral blood.Methods AFPmRNA in peripheral blood was detected in 71 case with PHC,21 cases with cirrhosis,28 normal healthy controls,4 cases with metastatic liver cancer,4 cases with liver hemangioma,4 cases with liver abscess and 5 cases with other maligant diseases by means of nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Results Human AFPmRNA was detected in 39 out of 71 cases of PHC(54.9%),in which 8 patients with distal metastasis were all positive and in 31 without distal metastasis the positive rate was 49.2% (P<0.01).AFPmRNA was also positive in 2 cases of cirrhosis (2/21,9.5%),but negative in normal healthy control,metastatic liver cancer,liver hemangioma,liver abscess and other maligant disease.Conclusions Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction is a very sensitive method for early detecting micrometastasis in patients with PHC,and suitable for extensive clinical application.
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〔Key words〕 primary hepatocellular carcinoma; alpha-fetoprotein(AFP); micrometastasis;nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction
原發(fā)性肝細胞癌的早期診斷率、可手術(shù)切除率近年來明顯提高。特別是正位肝移植手術(shù)的開展，使肝癌合并肝硬化患者治愈有一線曙光。但患者術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高，其主要原因之一是術(shù)前已發(fā)生了目前檢查手段未能檢測到的血道微轉(zhuǎn)移[1-2]。近年來多聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用，使檢測外周血中少量腫瘤細胞成為可能。作者采用巢式RT-PCR技術(shù)，以AFPmRNA為肝癌細胞的標志基因?qū)υl(fā)性肝細胞癌患者外周血中的腫瘤細胞進行檢測，并就AFPmRNA在原發(fā)性肝細胞癌血道轉(zhuǎn)移的診斷價值進行評價。
材料與方法
檢測對象：1997.2～1997.10我院住院原發(fā)性肝細胞癌71例，男63例，女8例，年齡17～70歲，平均44.9歲，經(jīng)手術(shù)切除病理證實23例；肝穿活檢病理證實6例，其余42例根據(jù)臨床表現(xiàn)、血清AFP和影像學技術(shù)確診。肝癌遠處轉(zhuǎn)移依靠X線片、B超、CT、MRI及全身骨掃描確診。肝硬化21例，男16例，女5例，年齡31～62歲，平均42.4歲。正常對照28例，男17例，女11例，年齡21～48歲，平均35.2歲，其中20例本院健康獻血人員。8例為無肝臟疾患的胃腸炎患者。轉(zhuǎn)移性肝癌4例，肝血管瘤4例，肝膿腫4例。
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標本收集：受檢者抽取肝素抗凝血5ml，用淋巴細胞分離液分離有核細胞，-70℃保存。同時抽血收集血清進行AFP檢測。
RNA提�。翰捎卯惲蚯杷犭�-酚-氯仿一步提取有核細胞總mRNA[3]，經(jīng)紫外分光光度計和變性膠電泳鑒定，證明制備RNA的純度及未被降解。
巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)：RF-PCR引物[4]由Sangon公司合成，引物序列見表1。根據(jù)引物設(shè)計，第一輪PCR產(chǎn)物長度為174bp，第二輪PCR終產(chǎn)物長度為101bp，內(nèi)含一個Pst Ⅰ核酸內(nèi)切酶位點，可將終產(chǎn)物酶切成60bp和41bp。可用此酶進行PCR擴增產(chǎn)物特異性鑒定。逆轉(zhuǎn)錄采用外端反義引物，M-MLV 200u,37℃，60分鐘。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 30秒，55℃ 40秒72℃ 40秒，循環(huán)40次，最后在72℃繼續(xù)延伸7分鐘。兩輪循環(huán)參數(shù)相同。產(chǎn)物可用電泳檢測，其特異性可用酶切分析。
, 百拇醫(yī)藥
表1 AFP-mRNA引物
引 物
位 置
序 列
Ex-Sense
90-112
5′-ACTGAATCCAGAACACTGCATAG-3′
Ex-antisense
263-241
5′-TGCAGTCAATGCATCTTTCACCA-3′
IN-sense
, 百拇醫(yī)藥
112-145
5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′
IN-antisense
222-200
5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGC-3′
統(tǒng)計分析：采用X2檢驗，分析各組間差異。
結(jié)果
1.PCR 產(chǎn)物分析2%瓊脂糖電泳，在紫外燈下，AFPmRNA陽性者可見101bp電泳帶。該產(chǎn)物用Pstl酶切后可分為61bp和40bp長度片段。結(jié)果見附圖1、2。
2.外周血AFPmRNA檢測結(jié)果：肝癌組外周血AFPmRNA檢出39/71(54.9%)例，肝硬化檢出2/21(9.5%)例，轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝內(nèi)膿腫、其它惡性腫瘤及健康對照均未檢出。見表2。
, 百拇醫(yī)藥
表2 各組外周血AFPmRNA檢測結(jié)果
例數(shù)
AFPmRNA(-)
AFPmRNA(+)
原發(fā)性肝細胞癌
71
32
39
肝硬化
21
19
2
轉(zhuǎn)移性肝癌
, 百拇醫(yī)藥
4
4
0
肝血管瘤
4
4
0
其他惡性腫瘤
5
5
0
胰頭癌
3
3
, 百拇醫(yī)藥
0
肝惡性淋巴瘤
1
1
0
肝肉瘤
1
1
0
肝膿腫
4
4
0
健康對照
, 百拇醫(yī)藥
28
28
0
3.血AFPmRNA與不同臨床參數(shù)的關(guān)系：將71例原發(fā)性肝癌患者按腫瘤大體分型大小、有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓及遠處轉(zhuǎn)移分成各組，各組AFPmRNA的陽性率見附表3和附表4。 表3 AFPmRNA與臨床參數(shù)
臨床參數(shù)
例數(shù)
AFP>20
P值
AFPmRNA
(+)(%)
P值
, 百拇醫(yī)藥
巨塊型
62
41(66.1%)
31(50.0%)
<5cm
11
6(54.4%)
2(18.3%)
≥5cm
51
35(68.5%)
29(56.9%)*
, 百拇醫(yī)藥
多發(fā)結(jié)節(jié)型
9
6(66.7%)
7(77.8%)
肝內(nèi)轉(zhuǎn)移
有
23
15(65.2%)
19(88.9%)
無
48
32(67.7%)
20(41.6%)**
, 百拇醫(yī)藥
門脈癌栓
有
21
13(61.9%)
17(80.9%)
無
50
33(66.0%)
22(44.0%)**
遠處轉(zhuǎn)移
有
8
5(62.5%)
, 百拇醫(yī)藥
8(100%)
無
63
43(68.3%)
31(49.2%)**
備注：與相應(yīng)對照組相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。 表4 AFPmRNA與肝癌分期的關(guān)系
臨床分期
Ⅰ(%)
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
AFPmRNA陽性
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2(18.3)
7(29.2)
30(83.3)
AFPmRNA陰性
9(81.7)
17(79.8)
6(16.7)
總 計
11
24
36
由表3可見，腫瘤直徑≥5cm的巨塊型肝癌AFPmRNA陽性率高于腫瘤直徑<5cm巨塊型肝癌(P<0.05)；有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓和遠處轉(zhuǎn)移組AFPmRNA的陽性率顯著高于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓和遠處轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；多結(jié)節(jié)性肝癌AFPmRNA陽性較巨塊型肝癌稍高，但無統(tǒng)計學意義(P=0.229)，而各組AFP血清水平無顯著差異(P>0.05)。
, 百拇醫(yī)藥
由表4可見，AFPmRNA與肝癌臨床分期明顯相關(guān)，Ⅲ期AFPmRNA陽性率和Ⅰ、Ⅱ期差別顯著(P<0.01)。
討論
原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的重要因素，也是肝癌治療失敗的主要原因之一。早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，對指導(dǎo)患者的治療、預(yù)后評價具有重要意義。近年來，一些研究者采用RT-PCR技術(shù)擴增腫瘤相關(guān)基因(標志基因)來檢測循環(huán)血(骨髓)中少量腫瘤細胞來判定腫瘤血道轉(zhuǎn)移的高危人群，早期診斷血道轉(zhuǎn)移。如Morno[5]等用前列腺特異性膜抗原(PSA)mRNA檢測外周血中前列腺癌細胞，Burchill[6]等用CK20mRNA檢測外周血(骨髓)中的結(jié)腸癌細胞等等。其中標志基因的選擇是決定檢測特異性和敏感性的關(guān)鍵因素。一般來說，標志基因必須滿足兩個基本條件：在腫瘤細胞中強表達，而在外周血細胞中不表達。
AFP是一種胚胎性蛋白，研究證實，AFPmRNA在肝癌細胞中強表達，正常成人在肝細胞中微量表達，而在外周血細胞中不表達[7-8]，因而可用AFPmRNA作為肝細胞癌的標志基因，進行血道轉(zhuǎn)移的檢測。
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本組以AFPmRNA作為標志基因應(yīng)用巢氏RT-PCR技術(shù)，檢測71例肝癌患者，陽性率為54.9%(39/71)；而在肝硬化組陽性率為9.5%(2/21)，轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝膿腫、其它腫瘤及健康對照均為陰性。肝癌病人AFPmRNA的陽性率較國外報道稍高[4，8]，可能本組晚期病人較多有關(guān)。而在肝硬化病人亦有AFPmRNA陽性的病例，推測可能在肝硬化進展過程中，由于肝纖維結(jié)構(gòu)破壞，有新生的肝細胞脫落入血所致，但其陽性率遠低于肝癌組。
本研究還發(fā)現(xiàn)，AFPmRNA 的檢出率與腫瘤的大小、臨床分期、門脈癌栓、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。>5cm的巨塊型肝癌遠較<5cm的肝癌陽性率高(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ期患者陽性率(18.3%、29.2%)遠較Ⅲ期患者陽性率(83.3%)低，差異明顯；AFPmRNA在門脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移高達80.9%和88.9%，遠處轉(zhuǎn)移患者高達100%，與國外研究報告基本一致[4，8]。提示外周血中肝癌細胞的出現(xiàn)與肝癌的進展密切相關(guān)，外周血細胞AFPmRNA 檢測對估計肝癌有無血行播散、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移有重要價值，可作為判斷肝癌患者預(yù)后和有無血道播散的重要指標。
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腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，侵蝕血管進入血循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的主要步驟之一[10]。Nakano[11]等報道，即使直徑<2cm的高分化肝細胞癌，腫瘤細胞也可能侵蝕血管壁形成血道微轉(zhuǎn)移。Koop[12]等用活體視頻顯微鏡(intravital videomicroscopy)觀察B16F10黑色素瘤細胞株在雞囊胚(chick embryos)血循環(huán)中的轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)24小時內(nèi)80%以上的黑色素瘤細胞能在血循環(huán)中存活并從血管滲出。而不是象過去想象的那樣大部分被血流的機械動力和免疫系統(tǒng)所破壞。動物實驗證實，大約0.01%循環(huán)血中的腫瘤細胞可在遠處器官生存下來，形成轉(zhuǎn)移灶。我們的實驗結(jié)果提示肝細胞癌血道播散發(fā)生的時間遠比過去認為的早，即使是小肝癌，也可能發(fā)生血道播散。并且，血道播散可能是一種較連續(xù)的過程。用RT-PCR技術(shù)檢測循環(huán)血中的肝癌細胞作為肝癌轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的標準，有助于判定目前檢測手段不能發(fā)現(xiàn)的無明顯臨床癥狀的早期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)病例，提高醫(yī)患的警惕性，加強隨診和給予恰當?shù)闹委�，是改善預(yù)后的重要措施。
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應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測循環(huán)血中的肝癌細胞是一種靈敏度高、特異性較強的方法，不僅可用來判定肝癌患者有無血道播散，而且可用于指導(dǎo)治療或判定療效。
作者簡介：周京旭(1969-)男，浙江安吉人，碩士，主治醫(yī)師，從事消化內(nèi)科專業(yè)。
參考文獻
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收稿日期：1999-5-10, 百拇醫(yī)藥
單位：周京旭(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；楊希山(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；袁愛力(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；林金容(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；林鴻(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；賴卓勝(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)；黃宇琦(第一軍醫(yī)大學南方醫(yī)院消化所 廣州 510515)
關(guān)鍵詞：原發(fā)性肝細胞癌；甲胎蛋白；微轉(zhuǎn)移；巢式逆轉(zhuǎn)錄PCR
應(yīng)用巢式RT 〔摘要〕 目的 以AFPmRNA為標志基因，檢測原發(fā)性肝細胞癌患者外周血中微轉(zhuǎn)移情況。方法 應(yīng)用巢式RT-PCR方法，檢測71例肝細胞癌、21例肝硬化患者、28例健康對照、4例轉(zhuǎn)移性肝癌、4例肝膿腫、4例肝血管瘤及5例其它惡性腫瘤患者外周血中AFPmRNA的表達。結(jié)果 71例肝癌患者中，AFPmRNA陽性39例，陽性率為54.9%，其中8例有遠處轉(zhuǎn)移的全部陽性(100%)，未發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移者陽性31例，陽性率為49.2%。21例肝硬化患者中僅2例陽性，而轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝膿腫、其它惡性腫瘤、健康對照均為陰性。結(jié)論 檢測肝細胞癌患者外周血中的AFPmRNA，是一種早期發(fā)現(xiàn)肝細胞癌血道播散的靈敏方法。
, http://www.www.srpcoatings.com
〔中圖分類號〕 R735.7；R730.43 〔文獻標識碼〕B
Detection of peripheral blood micrometastasis in patients with hepatocellular carcinoma by nested RT-PCR
ZHOU Jing-xu,YANG Xi-shan,YUAN Ai-li,et al.
(PLA Institute for Digestive Diseases,Nanfang Hospital,The First Military Medical University,Guangzhou 510515)
〔Abstract〕 Objective To detect hepatocyte-associated gene AFPmRNA to demonstrate micrometastasis in peripheral blood.Methods AFPmRNA in peripheral blood was detected in 71 case with PHC,21 cases with cirrhosis,28 normal healthy controls,4 cases with metastatic liver cancer,4 cases with liver hemangioma,4 cases with liver abscess and 5 cases with other maligant diseases by means of nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Results Human AFPmRNA was detected in 39 out of 71 cases of PHC(54.9%),in which 8 patients with distal metastasis were all positive and in 31 without distal metastasis the positive rate was 49.2% (P<0.01).AFPmRNA was also positive in 2 cases of cirrhosis (2/21,9.5%),but negative in normal healthy control,metastatic liver cancer,liver hemangioma,liver abscess and other maligant disease.Conclusions Nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction is a very sensitive method for early detecting micrometastasis in patients with PHC,and suitable for extensive clinical application.
, http://www.www.srpcoatings.com
〔Key words〕 primary hepatocellular carcinoma; alpha-fetoprotein(AFP); micrometastasis;nested reverse transcriptase-polymerase chain reaction
原發(fā)性肝細胞癌的早期診斷率、可手術(shù)切除率近年來明顯提高。特別是正位肝移植手術(shù)的開展，使肝癌合并肝硬化患者治愈有一線曙光。但患者術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高，其主要原因之一是術(shù)前已發(fā)生了目前檢查手段未能檢測到的血道微轉(zhuǎn)移[1-2]。近年來多聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的應(yīng)用，使檢測外周血中少量腫瘤細胞成為可能。作者采用巢式RT-PCR技術(shù)，以AFPmRNA為肝癌細胞的標志基因?qū)υl(fā)性肝細胞癌患者外周血中的腫瘤細胞進行檢測，并就AFPmRNA在原發(fā)性肝細胞癌血道轉(zhuǎn)移的診斷價值進行評價。
材料與方法
檢測對象：1997.2～1997.10我院住院原發(fā)性肝細胞癌71例，男63例，女8例，年齡17～70歲，平均44.9歲，經(jīng)手術(shù)切除病理證實23例；肝穿活檢病理證實6例，其余42例根據(jù)臨床表現(xiàn)、血清AFP和影像學技術(shù)確診。肝癌遠處轉(zhuǎn)移依靠X線片、B超、CT、MRI及全身骨掃描確診。肝硬化21例，男16例，女5例，年齡31～62歲，平均42.4歲。正常對照28例，男17例，女11例，年齡21～48歲，平均35.2歲，其中20例本院健康獻血人員。8例為無肝臟疾患的胃腸炎患者。轉(zhuǎn)移性肝癌4例，肝血管瘤4例，肝膿腫4例。
, http://www.www.srpcoatings.com
標本收集：受檢者抽取肝素抗凝血5ml，用淋巴細胞分離液分離有核細胞，-70℃保存。同時抽血收集血清進行AFP檢測。
RNA提�。翰捎卯惲蚯杷犭�-酚-氯仿一步提取有核細胞總mRNA[3]，經(jīng)紫外分光光度計和變性膠電泳鑒定，證明制備RNA的純度及未被降解。
巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)：RF-PCR引物[4]由Sangon公司合成，引物序列見表1。根據(jù)引物設(shè)計，第一輪PCR產(chǎn)物長度為174bp，第二輪PCR終產(chǎn)物長度為101bp，內(nèi)含一個Pst Ⅰ核酸內(nèi)切酶位點，可將終產(chǎn)物酶切成60bp和41bp。可用此酶進行PCR擴增產(chǎn)物特異性鑒定。逆轉(zhuǎn)錄采用外端反義引物，M-MLV 200u,37℃，60分鐘。PCR循環(huán)參數(shù)為：94℃ 30秒，55℃ 40秒72℃ 40秒，循環(huán)40次，最后在72℃繼續(xù)延伸7分鐘。兩輪循環(huán)參數(shù)相同。產(chǎn)物可用電泳檢測，其特異性可用酶切分析。
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表1 AFP-mRNA引物
引 物
位 置
序 列
Ex-Sense
90-112
5′-ACTGAATCCAGAACACTGCATAG-3′
Ex-antisense
263-241
5′-TGCAGTCAATGCATCTTTCACCA-3′
IN-sense
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112-145
5′-TGGAATAGCTTCCATATTGGATTC-3′
IN-antisense
222-200
5′-AAGTGGCTTCTTGAACAAACTGC-3′
統(tǒng)計分析：采用X2檢驗，分析各組間差異。
結(jié)果
1.PCR 產(chǎn)物分析2%瓊脂糖電泳，在紫外燈下，AFPmRNA陽性者可見101bp電泳帶。該產(chǎn)物用Pstl酶切后可分為61bp和40bp長度片段。結(jié)果見附圖1、2。
2.外周血AFPmRNA檢測結(jié)果：肝癌組外周血AFPmRNA檢出39/71(54.9%)例，肝硬化檢出2/21(9.5%)例，轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝內(nèi)膿腫、其它惡性腫瘤及健康對照均未檢出。見表2。
, 百拇醫(yī)藥
表2 各組外周血AFPmRNA檢測結(jié)果
例數(shù)
AFPmRNA(-)
AFPmRNA(+)
原發(fā)性肝細胞癌
71
32
39
肝硬化
21
19
2
轉(zhuǎn)移性肝癌
, 百拇醫(yī)藥
4
4
0
肝血管瘤
4
4
0
其他惡性腫瘤
5
5
0
胰頭癌
3
3
, 百拇醫(yī)藥
0
肝惡性淋巴瘤
1
1
0
肝肉瘤
1
1
0
肝膿腫
4
4
0
健康對照
, 百拇醫(yī)藥
28
28
0
3.血AFPmRNA與不同臨床參數(shù)的關(guān)系：將71例原發(fā)性肝癌患者按腫瘤大體分型大小、有無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓及遠處轉(zhuǎn)移分成各組，各組AFPmRNA的陽性率見附表3和附表4。 表3 AFPmRNA與臨床參數(shù)
臨床參數(shù)
例數(shù)
AFP>20
P值
AFPmRNA
(+)(%)
P值
, 百拇醫(yī)藥
巨塊型
62
41(66.1%)
31(50.0%)
<5cm
11
6(54.4%)
2(18.3%)
≥5cm
51
35(68.5%)
29(56.9%)*
, 百拇醫(yī)藥
多發(fā)結(jié)節(jié)型
9
6(66.7%)
7(77.8%)
肝內(nèi)轉(zhuǎn)移
有
23
15(65.2%)
19(88.9%)
無
48
32(67.7%)
20(41.6%)**
, 百拇醫(yī)藥
門脈癌栓
有
21
13(61.9%)
17(80.9%)
無
50
33(66.0%)
22(44.0%)**
遠處轉(zhuǎn)移
有
8
5(62.5%)
, 百拇醫(yī)藥
8(100%)
無
63
43(68.3%)
31(49.2%)**
備注：與相應(yīng)對照組相比，*表示P<0.05；**表示P<0.01。 表4 AFPmRNA與肝癌分期的關(guān)系
臨床分期
Ⅰ(%)
Ⅱ(%)
Ⅲ(%)
AFPmRNA陽性
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2(18.3)
7(29.2)
30(83.3)
AFPmRNA陰性
9(81.7)
17(79.8)
6(16.7)
總 計
11
24
36
由表3可見，腫瘤直徑≥5cm的巨塊型肝癌AFPmRNA陽性率高于腫瘤直徑<5cm巨塊型肝癌(P<0.05)；有肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓和遠處轉(zhuǎn)移組AFPmRNA的陽性率顯著高于無肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、門脈癌栓和遠處轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；多結(jié)節(jié)性肝癌AFPmRNA陽性較巨塊型肝癌稍高，但無統(tǒng)計學意義(P=0.229)，而各組AFP血清水平無顯著差異(P>0.05)。
, 百拇醫(yī)藥
由表4可見，AFPmRNA與肝癌臨床分期明顯相關(guān)，Ⅲ期AFPmRNA陽性率和Ⅰ、Ⅱ期差別顯著(P<0.01)。
討論
原發(fā)性肝癌的轉(zhuǎn)移是影響肝癌患者預(yù)后的重要因素，也是肝癌治療失敗的主要原因之一。早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，對指導(dǎo)患者的治療、預(yù)后評價具有重要意義。近年來，一些研究者采用RT-PCR技術(shù)擴增腫瘤相關(guān)基因(標志基因)來檢測循環(huán)血(骨髓)中少量腫瘤細胞來判定腫瘤血道轉(zhuǎn)移的高危人群，早期診斷血道轉(zhuǎn)移。如Morno[5]等用前列腺特異性膜抗原(PSA)mRNA檢測外周血中前列腺癌細胞，Burchill[6]等用CK20mRNA檢測外周血(骨髓)中的結(jié)腸癌細胞等等。其中標志基因的選擇是決定檢測特異性和敏感性的關(guān)鍵因素。一般來說，標志基因必須滿足兩個基本條件：在腫瘤細胞中強表達，而在外周血細胞中不表達。
AFP是一種胚胎性蛋白，研究證實，AFPmRNA在肝癌細胞中強表達，正常成人在肝細胞中微量表達，而在外周血細胞中不表達[7-8]，因而可用AFPmRNA作為肝細胞癌的標志基因，進行血道轉(zhuǎn)移的檢測。
, 百拇醫(yī)藥
本組以AFPmRNA作為標志基因應(yīng)用巢氏RT-PCR技術(shù)，檢測71例肝癌患者，陽性率為54.9%(39/71)；而在肝硬化組陽性率為9.5%(2/21)，轉(zhuǎn)移性肝癌、肝血管瘤、肝膿腫、其它腫瘤及健康對照均為陰性。肝癌病人AFPmRNA的陽性率較國外報道稍高[4，8]，可能本組晚期病人較多有關(guān)。而在肝硬化病人亦有AFPmRNA陽性的病例，推測可能在肝硬化進展過程中，由于肝纖維結(jié)構(gòu)破壞，有新生的肝細胞脫落入血所致，但其陽性率遠低于肝癌組。
本研究還發(fā)現(xiàn)，AFPmRNA 的檢出率與腫瘤的大小、臨床分期、門脈癌栓、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。>5cm的巨塊型肝癌遠較<5cm的肝癌陽性率高(P<0.05)。Ⅰ、Ⅱ期患者陽性率(18.3%、29.2%)遠較Ⅲ期患者陽性率(83.3%)低，差異明顯；AFPmRNA在門脈癌栓、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移高達80.9%和88.9%，遠處轉(zhuǎn)移患者高達100%，與國外研究報告基本一致[4，8]。提示外周血中肝癌細胞的出現(xiàn)與肝癌的進展密切相關(guān)，外周血細胞AFPmRNA 檢測對估計肝癌有無血行播散、肝內(nèi)和肝外轉(zhuǎn)移有重要價值，可作為判斷肝癌患者預(yù)后和有無血道播散的重要指標。
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腫瘤細胞從原發(fā)部位脫落，侵蝕血管進入血循環(huán)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的主要步驟之一[10]。Nakano[11]等報道，即使直徑<2cm的高分化肝細胞癌，腫瘤細胞也可能侵蝕血管壁形成血道微轉(zhuǎn)移。Koop[12]等用活體視頻顯微鏡(intravital videomicroscopy)觀察B16F10黑色素瘤細胞株在雞囊胚(chick embryos)血循環(huán)中的轉(zhuǎn)歸，發(fā)現(xiàn)24小時內(nèi)80%以上的黑色素瘤細胞能在血循環(huán)中存活并從血管滲出。而不是象過去想象的那樣大部分被血流的機械動力和免疫系統(tǒng)所破壞。動物實驗證實，大約0.01%循環(huán)血中的腫瘤細胞可在遠處器官生存下來，形成轉(zhuǎn)移灶。我們的實驗結(jié)果提示肝細胞癌血道播散發(fā)生的時間遠比過去認為的早，即使是小肝癌，也可能發(fā)生血道播散。并且，血道播散可能是一種較連續(xù)的過程。用RT-PCR技術(shù)檢測循環(huán)血中的肝癌細胞作為肝癌轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)的標準，有助于判定目前檢測手段不能發(fā)現(xiàn)的無明顯臨床癥狀的早期轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)病例，提高醫(yī)患的警惕性，加強隨診和給予恰當?shù)闹委�，是改善預(yù)后的重要措施。
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應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測循環(huán)血中的肝癌細胞是一種靈敏度高、特異性較強的方法，不僅可用來判定肝癌患者有無血道播散，而且可用于指導(dǎo)治療或判定療效。
作者簡介：周京旭(1969-)男，浙江安吉人，碩士，主治醫(yī)師，從事消化內(nèi)科專業(yè)。
參考文獻
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收稿日期：1999-5-10, 百拇醫(yī)藥