23-羥基樺木酸體外和體內抗黑色素瘤作用的研究
作者:葉銀英 何道偉 葉文才 張慶文 趙守訓
單位:葉銀英(南京鐵道醫(yī)學院科學研究所 南京 210009);何道偉(南京鐵道醫(yī)學院科學研究所 南京 210009);葉文才(中國藥科大學天然藥物化學教研室);張慶文(中國藥科大學天然藥物化學教研室);趙守訓(中國藥科大學天然藥物化學教研室)
關鍵詞:23-羥基樺木酸;黑色素瘤細胞;細胞凋亡
23 〔摘要〕 目的 研究23-羥基樺木酸對體內、外B16黑色素瘤細胞生長的抑制及誘導凋亡作用。方法 應用MTT分析,電鏡觀察,流式細胞儀,腫瘤體積大小測定等方法,對23-羥基樺木酸誘導黑色素瘤細胞進行檢測和觀察。結果 23-羥基樺木酸體外30~80μg/ml處理,體內300mg/kg~600mg/kg灌胃時,對B16細胞有顯著的生長抑制作用,有一定的劑量依賴關系并出現(xiàn)大量的凋亡細胞,同時體內腫瘤細胞被阻滯在G0~G1期,DNA合成受阻,腫瘤體積縮小。結論 23-羥基樺木酸對體內外黑色素瘤細胞增殖有強烈的抑制作用,誘導腫瘤細胞死亡的主要途徑是凋亡。
, 百拇醫(yī)藥
〔中圖分類號〕 R730.53;R739.5 〔文獻標識碼〕 A
The study of 23-hydroxyl betulinic acid against melanoma in vivo and in vitro
YE Yin-ying,HE Dao-wei,YE Wen-cai et al.
(Research institute of medicine,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009)
〔Abstract〕 Objective To study 23-hydroxyl betulinic acid induced apoptosis and growth inhibition of B16 melanoma cell in vivo and in vitro.Methods MTT assay,electronic microscopy,flow cytometry and tumor volume assay were used to examine the effect of 23-hydroxyl betulinic acid on B16 melanoma cell line.Results 30~80μg/ml 23-hydroxyl betulinic acid in vitro and 300mg/kg~600mg/kg P.O.in vitro markedly inhibited the growth of B16 cells at a dose-dependent manner with a great number of apoptotic cells seen.Tumor size decreased markedly.Flow cytometry showed cell accumulation at G0~G1 stage and DNA synthesis retardation.Conclusions 23-hydroxyl betulinic acid potently inhibited the growth of B16 cell that functioned by induction of apoptosis.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 23-hydroxyl betulinic acid;B16 melanoma cell;apoptosis
23-羥基樺木酸是從中藥提取的衍生物,具有最有效的抗黑色素瘤成分。本中藥具有清熱解毒作用,由它提取的化合物經(jīng)體外抑瘤實驗,都有抑制黑色素瘤的活性成分,通過7種衍生物抑瘤實驗的比較、分析,表明23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞抑制最明顯。體外抑制黑色素瘤作用明顯,對體內是否也有明顯的抑制作用呢?我們以B16黑色素瘤細胞系為材料,進行體內、體外抑瘤實驗的比較研究,確定它的療效,為尋找新的臨床治療藥物提供理論依據(jù)。
材料和方法
一、材料:細胞系培養(yǎng)條件:小鼠黑色素瘤細胞系B16和人黑色素瘤細胞系A375由上海細胞所引進,培養(yǎng)在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,用0.25%胰酶消化傳代,每兩天傳一次代。藥物配制:23-羥基樺木酸由中國藥科大學天然藥物化學教研室分離、提取。體外給藥的配制:將提取的23-羥基樺木酸粉末高溫、高壓滅菌,然后用0.05%的DMSO溶解粉末,用含有血清的RPMI1640配成100μg/ml的原液呈懸浮狀,放入4℃冰箱,經(jīng)常搖動,再用含有血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成需要的濃度。體內給藥的藥物配制:將提取的23-羥基樺木酸用研缽研磨細后,再用蒸餾水配成所需濃度的懸液。實驗動物:BALB/C小鼠,2月齡,體重18~22g,雌雄各半。
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二、方法:1.MTT實驗:將10、20、40、80μg/ml 23-羥基樺木酸的藥物濃度作用于96孔板細胞中培養(yǎng)3天,每孔加入5μg/ml MTT(Sigma)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,輕輕吸去上清液,加入1N HCL-異丙醇。每孔的沉淀物,用吸管用力吹打均勻,在核酸蛋白檢測儀(型號SPECTRA MAX-250,波長570 nm)進行檢測。生長抑制率=[1-(實驗孔的OD值/對照孔的OD值)]×100%。2.荷瘤小鼠的抑瘤實驗:取小鼠B16細胞系對數(shù)生長期細胞,用生理鹽水配成一定濃度接種于BALB/C小鼠的腳掌(2.4×106/只)。共分5組,對照組(不給藥),100mg/kg,300mg/kg,600mg/kg,前四組在接種B16黑色素瘤細胞后的第二天就連續(xù)15天給小鼠灌胃。最后一組在前四組已灌胃10天,這組小鼠腫瘤平均體積已長至11.38mm3,再開始給藥,同樣連續(xù)灌胃15天停藥,以后每3天用游標卡尺測一次腫瘤體積,公式:a×b2(a為長徑,b為短徑)。3.腫瘤組織的電鏡觀察:小鼠實驗結束時,取100μg/ml,300μg/ml,對照組小鼠的腫瘤組織塊進行常規(guī)的戊二醛固定、包埋后,切片測定并進行拍照記錄。4.細胞周期及DNA碎片的分析:小鼠實驗結束時,取300mg/kg,600mg/kg(形成腫瘤后再治療的小鼠),對照組的腫瘤組織塊,用剪刀剪碎、勻漿、尼龍網(wǎng)過濾,用PBS洗滌3次,1000轉/分離心,加1%Triton-X-100,33℃孵育,離心,加0.01%KNA酶消化,離心,加0.005%PI染色,用300目尼龍網(wǎng)過濾,15分鐘后上機檢測(美國BD公司FACS Calibur機)。
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結果
一、23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞增殖的影響:
從圖1、圖2中看出,不同濃度的23-羥基樺木酸作用于黑色素瘤細胞3天,都受到不同程度的抑制。經(jīng)統(tǒng)計學t檢驗分析,有顯著差異,40μg/ml~80μg/ml的濃度與對照組比較,P<0.001。用MTT法測得人A375細胞的半數(shù)抑制量IC50為11.46μg/ml,小鼠B16細胞為17.99μg/ml。23-羥基樺木酸對人A375細胞系的敏感性高于B16細胞系。同一濃度的藥物作用于細胞時間不同,顯示出抑制效應也不同,隨著藥物作用時間的延長,對腫瘤細胞的抑制率增加(圖3)。
圖1 23-羥基樺木酸對人A375黑色素瘤細胞增殖的影響
, 百拇醫(yī)藥
圖2 23-羥基樺木酸對小鼠B16黑色素瘤細胞增殖的影響
圖3 23-羥基樺木酸對小鼠B16黑色素瘤細胞的時間抑制效應
二、體內抑瘤作用:1.第一批體內抑瘤實驗:每只BALB/C小鼠腳掌接種B16細胞1.5×106,第二天進行灌胃治療,與對照組比較,腫瘤形成能力明顯降低,30天后,對照組4/9小鼠生長腫瘤,而600mg/ml組在接種后18天,有3/9小鼠長瘤,至21天只有2/6長瘤,第26天全部縮小退去(0/9)。從表1中可以看出,隨著藥物劑量的增加,小鼠長瘤的數(shù)目減少。
表1 23-羥基樺木酸對B16黑色素瘤細胞體內抑瘤的影響
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組別
藥和物濃度
(μg/ml)
長瘤小鼠數(shù)
腫瘤體積大小
1
0
4/9(44.4%)
米粒大小
2
100
3/9(33.3%)
半個米粒大小
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3
300
2/10(20%)
半個米粒大小
4
600
0/9(0)
腫瘤消失
2.第一批體內抑瘤實驗:每只BALB/C小鼠腳掌接種B16細胞2.4×106,40天后全部處死小鼠,剝離腫瘤組織進行稱重。從表2可以看出,隨著藥物濃度的增加,組織塊重量減小,腫瘤的抑制率上升。 表2 23-羥基樺木酸對B16細胞的體內抑瘤作用
藥物劑量
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(mg/kg)
給藥程序
小鼠數(shù)量
(只)
腫瘤重量
(mg)
抑瘤率
(%)
0
第二天灌胃
12
200
/
, 百拇醫(yī)藥
100
第二天灌胃
10
180
10
300
第二天灌胃
11
100
50
600
第二天灌胃
10
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50
75
600
第十天灌胃
8
50
75
從圖4中可以看出,100,300,600mg/kg三組小鼠在接種B16黑色素瘤細胞后的第二天,就進行藥物治療,第八天給藥組與不給藥組都開始長腫瘤,但與對照組比較,腫瘤體積明顯要小一些,隨著時間的延長,腫瘤縮小更多些。最后一組600mg/kg組在接種腫瘤細胞后第十天開始藥物治療,腫瘤已長至11.38mm3,腫瘤繼續(xù)長大,第十二天,腫瘤體積長到13.94mm3,然后逐漸縮小,到40天時平均體積只有5.75mm3,與開始治療時比較,8只小鼠有7只小鼠瘤塊消退。
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圖4 23-羥基樺木酸對B16腫瘤細胞的抑制作用
圖5A B16細胞(對照組)×6000
三、電鏡觀察:電鏡下,體內、體外,加藥與不加藥黑色素瘤B16細胞形態(tài)相比(圖5A),可見加藥后B16細胞發(fā)生了典型的凋亡細胞形態(tài)變化,細胞變小、胞漿濃縮、內質網(wǎng)擴張、核仁消失、染色質聚集濃縮為一個或數(shù)個團塊,有時可形成新月帽狀,許多細胞內出現(xiàn)空泡,最后形成外膜包繞的內涵物不外溢凋亡小體(圖5B、圖5C)。
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圖5B 體外給藥30μg/ml×6000
圖5C 體內給藥300mg/kg×4000
四、23-羥基樺木酸對B16細胞周期的影響:用300,600mg/kg藥物及蒸餾水治療荷瘤小鼠15天,40天后處死小鼠,取出腫瘤組織進行細胞流式儀檢測,結果表明,用300,600mg/kg23-羥基樺木酸治療小鼠,B16黑色素瘤細胞被阻斷在G0~G1期,S期明顯減少(表3),使DNA合成能力降低,因而治療小鼠的腫瘤塊明顯縮小。
表3 23-羥基樺木酸對B16黑色素瘤細胞周期的影響
組別
, 百拇醫(yī)藥
G1(%)
S(%)
G2+M(%)
0
85.55
4.44
10.01
300(mg/kg)
94.71
2.92
2.37
600(mg/kg)
97.19
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0
2.81
討論
一、23-羥基樺木酸對體外黑色素瘤B16細胞有明顯的抑瘤作用,電鏡下觀察到典型的凋亡細胞,流式細胞儀(FCM)上檢測到凋亡峰的劑量效應關系(30μg/ml藥物處理24小時有10.24%的細胞發(fā)生凋亡,50μg/ml有14.88%,對照組也有3.51%細胞發(fā)生凋亡)。說明藥物抑瘤作用與腫瘤細胞凋亡有關,有的作者認為在尋找癌有效抑制的其它方法及藥物時,應將誘導細胞凋亡的能力作為一個重要指標[1-2]。
二、腫瘤細胞凋亡研究已成為人們普遍關注的生命科學領域中的一大熱點[3],抗腫瘤藥物常能誘導敏感的腫瘤細胞凋亡,并且抗腫瘤效能與腫瘤細胞在它的誘導下發(fā)生凋亡的敏感程度有關[4]。中藥提取的23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞抗腫瘤作用,低劑量(20~40μg/ml處理48小時)誘導細胞分化,細胞形態(tài)由堆積變?yōu)槠戒仯c苯乙酸鈉誘導黑色素瘤細胞形態(tài)變化類似,呈一定的極性生長[5]。小鼠用300~600mg/kg藥物灌胃治療移植的黑色素瘤,經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)大量的細胞被阻滯在G0~G1期,進入S期的細胞數(shù)量減少,使細胞DNA合成能力降低,從而使腫瘤體積縮小。
, 百拇醫(yī)藥
三、樺樹皮提取的樺木酸能誘導黑色素瘤細胞凋亡[6],F(xiàn)ulda S等進一步研究,認為是引起細胞內線粒體通透性改變,最后導致細胞凋亡[7],最近國外一些報導,樺木酸對HIV[8]、神經(jīng)母細胞瘤[9]等有很好的療效,故樺木酸是很有開發(fā)前景的藥物。
基金項目:國家自然科學基金資助課題(39770898)
作者簡介:葉銀英(1939-),女,上海浦東人,研究員。從事細胞生物學工作。
參考文獻
1,廖泉,趙玉沛,蔡力行等.化療藥物不同配伍誘導人胰腺癌細胞株凋亡.中國醫(yī)學科學院學報,1999;21(2):122
2,Lowe S W,HE.Ruley,T.Jncks et al.P53-dependent apoptosis modulates the cytotoxicity of anticancer agents.Cell,1993;74:957
, 百拇醫(yī)藥
3,曹世龍.腫瘤學新理論與新技術.上?萍冀逃霭嫔,1997;284
4,Dive C, J.A.Hickman.Drug-target interaction:only the first step in the commitment to a programmed cell death.Br J Cancer,1991;64:192
5,葉銀英,何道偉,楊天明等.苯乙酸鈉對小鼠B16黑色素瘤細胞分化誘導作用.中國腫瘤臨床與康復,1998;5(4)
6,Pish E.,H.chai IS.Lec et al.Discovery of betulinc acid as a selective inhibition of human melanoma that functions by induction of apoptosis.Nat Med,1995;1(10):1046
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7,Vietinck-AJ,De-Bruyen-T,Apere-S,et al.Plant-derived leading compound for chemotherapy of human immunodeficiency virus (HIV)infection.Planta med.1998;64(2):97
8,F(xiàn)ulda-S,C-Scaffidi, SA.Susin et al.Molecular ordering of apoptosis induced by anticancer drugs in neuroblastoma cells.Cancer Res,1998;64(2):97
9,F(xiàn)ulda S,C-Scaffidi,SA.Susin et al.Activation of mitochondria and release of mitochondrial apoptogenic factors by betulinic acid.J Biol Chem,1998;273(51):53942-8, 百拇醫(yī)藥
單位:葉銀英(南京鐵道醫(yī)學院科學研究所 南京 210009);何道偉(南京鐵道醫(yī)學院科學研究所 南京 210009);葉文才(中國藥科大學天然藥物化學教研室);張慶文(中國藥科大學天然藥物化學教研室);趙守訓(中國藥科大學天然藥物化學教研室)
關鍵詞:23-羥基樺木酸;黑色素瘤細胞;細胞凋亡
23 〔摘要〕 目的 研究23-羥基樺木酸對體內、外B16黑色素瘤細胞生長的抑制及誘導凋亡作用。方法 應用MTT分析,電鏡觀察,流式細胞儀,腫瘤體積大小測定等方法,對23-羥基樺木酸誘導黑色素瘤細胞進行檢測和觀察。結果 23-羥基樺木酸體外30~80μg/ml處理,體內300mg/kg~600mg/kg灌胃時,對B16細胞有顯著的生長抑制作用,有一定的劑量依賴關系并出現(xiàn)大量的凋亡細胞,同時體內腫瘤細胞被阻滯在G0~G1期,DNA合成受阻,腫瘤體積縮小。結論 23-羥基樺木酸對體內外黑色素瘤細胞增殖有強烈的抑制作用,誘導腫瘤細胞死亡的主要途徑是凋亡。
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〔中圖分類號〕 R730.53;R739.5 〔文獻標識碼〕 A
The study of 23-hydroxyl betulinic acid against melanoma in vivo and in vitro
YE Yin-ying,HE Dao-wei,YE Wen-cai et al.
(Research institute of medicine,Nanjing Railway Medical College,Nanjing 210009)
〔Abstract〕 Objective To study 23-hydroxyl betulinic acid induced apoptosis and growth inhibition of B16 melanoma cell in vivo and in vitro.Methods MTT assay,electronic microscopy,flow cytometry and tumor volume assay were used to examine the effect of 23-hydroxyl betulinic acid on B16 melanoma cell line.Results 30~80μg/ml 23-hydroxyl betulinic acid in vitro and 300mg/kg~600mg/kg P.O.in vitro markedly inhibited the growth of B16 cells at a dose-dependent manner with a great number of apoptotic cells seen.Tumor size decreased markedly.Flow cytometry showed cell accumulation at G0~G1 stage and DNA synthesis retardation.Conclusions 23-hydroxyl betulinic acid potently inhibited the growth of B16 cell that functioned by induction of apoptosis.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 23-hydroxyl betulinic acid;B16 melanoma cell;apoptosis
23-羥基樺木酸是從中藥提取的衍生物,具有最有效的抗黑色素瘤成分。本中藥具有清熱解毒作用,由它提取的化合物經(jīng)體外抑瘤實驗,都有抑制黑色素瘤的活性成分,通過7種衍生物抑瘤實驗的比較、分析,表明23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞抑制最明顯。體外抑制黑色素瘤作用明顯,對體內是否也有明顯的抑制作用呢?我們以B16黑色素瘤細胞系為材料,進行體內、體外抑瘤實驗的比較研究,確定它的療效,為尋找新的臨床治療藥物提供理論依據(jù)。
材料和方法
一、材料:細胞系培養(yǎng)條件:小鼠黑色素瘤細胞系B16和人黑色素瘤細胞系A375由上海細胞所引進,培養(yǎng)在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中,用0.25%胰酶消化傳代,每兩天傳一次代。藥物配制:23-羥基樺木酸由中國藥科大學天然藥物化學教研室分離、提取。體外給藥的配制:將提取的23-羥基樺木酸粉末高溫、高壓滅菌,然后用0.05%的DMSO溶解粉末,用含有血清的RPMI1640配成100μg/ml的原液呈懸浮狀,放入4℃冰箱,經(jīng)常搖動,再用含有血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成需要的濃度。體內給藥的藥物配制:將提取的23-羥基樺木酸用研缽研磨細后,再用蒸餾水配成所需濃度的懸液。實驗動物:BALB/C小鼠,2月齡,體重18~22g,雌雄各半。
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二、方法:1.MTT實驗:將10、20、40、80μg/ml 23-羥基樺木酸的藥物濃度作用于96孔板細胞中培養(yǎng)3天,每孔加入5μg/ml MTT(Sigma)20μl,繼續(xù)培養(yǎng)4小時,輕輕吸去上清液,加入1N HCL-異丙醇。每孔的沉淀物,用吸管用力吹打均勻,在核酸蛋白檢測儀(型號SPECTRA MAX-250,波長570 nm)進行檢測。生長抑制率=[1-(實驗孔的OD值/對照孔的OD值)]×100%。2.荷瘤小鼠的抑瘤實驗:取小鼠B16細胞系對數(shù)生長期細胞,用生理鹽水配成一定濃度接種于BALB/C小鼠的腳掌(2.4×106/只)。共分5組,對照組(不給藥),100mg/kg,300mg/kg,600mg/kg,前四組在接種B16黑色素瘤細胞后的第二天就連續(xù)15天給小鼠灌胃。最后一組在前四組已灌胃10天,這組小鼠腫瘤平均體積已長至11.38mm3,再開始給藥,同樣連續(xù)灌胃15天停藥,以后每3天用游標卡尺測一次腫瘤體積,公式:a×b2(a為長徑,b為短徑)。3.腫瘤組織的電鏡觀察:小鼠實驗結束時,取100μg/ml,300μg/ml,對照組小鼠的腫瘤組織塊進行常規(guī)的戊二醛固定、包埋后,切片測定并進行拍照記錄。4.細胞周期及DNA碎片的分析:小鼠實驗結束時,取300mg/kg,600mg/kg(形成腫瘤后再治療的小鼠),對照組的腫瘤組織塊,用剪刀剪碎、勻漿、尼龍網(wǎng)過濾,用PBS洗滌3次,1000轉/分離心,加1%Triton-X-100,33℃孵育,離心,加0.01%KNA酶消化,離心,加0.005%PI染色,用300目尼龍網(wǎng)過濾,15分鐘后上機檢測(美國BD公司FACS Calibur機)。
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結果
一、23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞增殖的影響:
從圖1、圖2中看出,不同濃度的23-羥基樺木酸作用于黑色素瘤細胞3天,都受到不同程度的抑制。經(jīng)統(tǒng)計學t檢驗分析,有顯著差異,40μg/ml~80μg/ml的濃度與對照組比較,P<0.001。用MTT法測得人A375細胞的半數(shù)抑制量IC50為11.46μg/ml,小鼠B16細胞為17.99μg/ml。23-羥基樺木酸對人A375細胞系的敏感性高于B16細胞系。同一濃度的藥物作用于細胞時間不同,顯示出抑制效應也不同,隨著藥物作用時間的延長,對腫瘤細胞的抑制率增加(圖3)。
圖1 23-羥基樺木酸對人A375黑色素瘤細胞增殖的影響
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圖2 23-羥基樺木酸對小鼠B16黑色素瘤細胞增殖的影響
圖3 23-羥基樺木酸對小鼠B16黑色素瘤細胞的時間抑制效應
二、體內抑瘤作用:1.第一批體內抑瘤實驗:每只BALB/C小鼠腳掌接種B16細胞1.5×106,第二天進行灌胃治療,與對照組比較,腫瘤形成能力明顯降低,30天后,對照組4/9小鼠生長腫瘤,而600mg/ml組在接種后18天,有3/9小鼠長瘤,至21天只有2/6長瘤,第26天全部縮小退去(0/9)。從表1中可以看出,隨著藥物劑量的增加,小鼠長瘤的數(shù)目減少。
表1 23-羥基樺木酸對B16黑色素瘤細胞體內抑瘤的影響
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組別
藥和物濃度
(μg/ml)
長瘤小鼠數(shù)
腫瘤體積大小
1
0
4/9(44.4%)
米粒大小
2
100
3/9(33.3%)
半個米粒大小
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3
300
2/10(20%)
半個米粒大小
4
600
0/9(0)
腫瘤消失
2.第一批體內抑瘤實驗:每只BALB/C小鼠腳掌接種B16細胞2.4×106,40天后全部處死小鼠,剝離腫瘤組織進行稱重。從表2可以看出,隨著藥物濃度的增加,組織塊重量減小,腫瘤的抑制率上升。 表2 23-羥基樺木酸對B16細胞的體內抑瘤作用
藥物劑量
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(mg/kg)
給藥程序
小鼠數(shù)量
(只)
腫瘤重量
(mg)
抑瘤率
(%)
0
第二天灌胃
12
200
/
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100
第二天灌胃
10
180
10
300
第二天灌胃
11
100
50
600
第二天灌胃
10
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50
75
600
第十天灌胃
8
50
75
從圖4中可以看出,100,300,600mg/kg三組小鼠在接種B16黑色素瘤細胞后的第二天,就進行藥物治療,第八天給藥組與不給藥組都開始長腫瘤,但與對照組比較,腫瘤體積明顯要小一些,隨著時間的延長,腫瘤縮小更多些。最后一組600mg/kg組在接種腫瘤細胞后第十天開始藥物治療,腫瘤已長至11.38mm3,腫瘤繼續(xù)長大,第十二天,腫瘤體積長到13.94mm3,然后逐漸縮小,到40天時平均體積只有5.75mm3,與開始治療時比較,8只小鼠有7只小鼠瘤塊消退。
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圖4 23-羥基樺木酸對B16腫瘤細胞的抑制作用
圖5A B16細胞(對照組)×6000
三、電鏡觀察:電鏡下,體內、體外,加藥與不加藥黑色素瘤B16細胞形態(tài)相比(圖5A),可見加藥后B16細胞發(fā)生了典型的凋亡細胞形態(tài)變化,細胞變小、胞漿濃縮、內質網(wǎng)擴張、核仁消失、染色質聚集濃縮為一個或數(shù)個團塊,有時可形成新月帽狀,許多細胞內出現(xiàn)空泡,最后形成外膜包繞的內涵物不外溢凋亡小體(圖5B、圖5C)。
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圖5B 體外給藥30μg/ml×6000
圖5C 體內給藥300mg/kg×4000
四、23-羥基樺木酸對B16細胞周期的影響:用300,600mg/kg藥物及蒸餾水治療荷瘤小鼠15天,40天后處死小鼠,取出腫瘤組織進行細胞流式儀檢測,結果表明,用300,600mg/kg23-羥基樺木酸治療小鼠,B16黑色素瘤細胞被阻斷在G0~G1期,S期明顯減少(表3),使DNA合成能力降低,因而治療小鼠的腫瘤塊明顯縮小。
表3 23-羥基樺木酸對B16黑色素瘤細胞周期的影響
組別
, 百拇醫(yī)藥
G1(%)
S(%)
G2+M(%)
0
85.55
4.44
10.01
300(mg/kg)
94.71
2.92
2.37
600(mg/kg)
97.19
, http://www.www.srpcoatings.com
0
2.81
討論
一、23-羥基樺木酸對體外黑色素瘤B16細胞有明顯的抑瘤作用,電鏡下觀察到典型的凋亡細胞,流式細胞儀(FCM)上檢測到凋亡峰的劑量效應關系(30μg/ml藥物處理24小時有10.24%的細胞發(fā)生凋亡,50μg/ml有14.88%,對照組也有3.51%細胞發(fā)生凋亡)。說明藥物抑瘤作用與腫瘤細胞凋亡有關,有的作者認為在尋找癌有效抑制的其它方法及藥物時,應將誘導細胞凋亡的能力作為一個重要指標[1-2]。
二、腫瘤細胞凋亡研究已成為人們普遍關注的生命科學領域中的一大熱點[3],抗腫瘤藥物常能誘導敏感的腫瘤細胞凋亡,并且抗腫瘤效能與腫瘤細胞在它的誘導下發(fā)生凋亡的敏感程度有關[4]。中藥提取的23-羥基樺木酸對黑色素瘤細胞抗腫瘤作用,低劑量(20~40μg/ml處理48小時)誘導細胞分化,細胞形態(tài)由堆積變?yōu)槠戒仯c苯乙酸鈉誘導黑色素瘤細胞形態(tài)變化類似,呈一定的極性生長[5]。小鼠用300~600mg/kg藥物灌胃治療移植的黑色素瘤,經(jīng)FCM檢測發(fā)現(xiàn)大量的細胞被阻滯在G0~G1期,進入S期的細胞數(shù)量減少,使細胞DNA合成能力降低,從而使腫瘤體積縮小。
, 百拇醫(yī)藥
三、樺樹皮提取的樺木酸能誘導黑色素瘤細胞凋亡[6],F(xiàn)ulda S等進一步研究,認為是引起細胞內線粒體通透性改變,最后導致細胞凋亡[7],最近國外一些報導,樺木酸對HIV[8]、神經(jīng)母細胞瘤[9]等有很好的療效,故樺木酸是很有開發(fā)前景的藥物。
基金項目:國家自然科學基金資助課題(39770898)
作者簡介:葉銀英(1939-),女,上海浦東人,研究員。從事細胞生物學工作。
參考文獻
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