肝細(xì)胞癌中Bcl-2、C-myc表達(dá)的定量檢測及其與預(yù)后的關(guān)系
作者：李華 潘承恩 劉青光 于良 馬清涌
單位：李華(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；潘承恩(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；劉青光(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；于良(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；馬清涌(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)
關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；原癌基因；基因表達(dá)；免疫組織化學(xué)；預(yù)后
肝細(xì)胞癌中Bcl 〔摘要〕 目的 探討B(tài)cl-2及C-myc蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后之間的關(guān)系，以及兩者可能具有的協(xié)同性。方法 應(yīng)用免疫組化雙標(biāo)記法(SABC)檢測肝癌組織、癌周組織及正常肝組織中兩者的表達(dá)，并用圖像分析系統(tǒng)加以定量分析。結(jié)果 Bcl-2在三種組織中的表達(dá)量(PU值)分別為21.097±3.460、8.635±1.384、3.059±0.128，C-myc分別為36.702±4.961、10.585±1.263、1.547±0.043，均具顯著性差異(P<0.01)。在肝細(xì)胞癌無腫瘤被膜組中具有高Bcl-2表達(dá)(P<0.05)，而在肝硬化、具有門脈癌栓、無腫瘤被膜、高病理分級及高TNM分期者中具有高C-myc表達(dá)(P<0.05)。高Bcl-2或/和C-myc表達(dá)均與較差預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型回歸分析可知C-myc為一獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。結(jié)論 Bcl-2與肝細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)，C-myc與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并可獨(dú)立判斷預(yù)后。兩癌基因具有一定協(xié)同致癌性。
, 百拇醫(yī)藥
〔中圖分類號〕 R730.45；R735.7 〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕B
Expression of Bcl-2、C-myc protein in hepatocellular carcinoma and its relation with the prognosis
LI Hua, PAN Cheng-en, LIU Qing-guang,et al.
(Department of Hepatobiliary Surgery,The First Clinical Medical College,Xi′an Medical University,Xi′an 710061)
〔Abstract〕 Objective To evaluate the effect of the expression of Bcl-2、C-myc protein in the oncogenesis、development and prognosis in hepatocellular carcinoma(HCC),and the correlation of the two oncogenes.Methods Immunohistochemical double staining technique(SABC) was used to detect the expression of the two genes in HCC tissues、liver tissues adjacent to cancer and normal liver tissues,which was also quantitatively analysed by the image system.Results The positive unit(PU)of Bcl-2 protein in three kinds of tissues were 21.097±3.460,8.635±1.384,3.059±0.128 respectively,(P<0.01);the PU of C-myc were 36.702±4.961,10.585±1.263,1.547±0.043, respectively (P<0.01).Expression of Bcl-2 in tumor without capsule was significantly higher than that in the control(P<0.05).The higher positive-staining expression of C-myc were found in the case of cirrhosis and tumor thrombi in the portal vein (TTPV),as well as in the case of tumor without capsule,with higher pathological grade and higher TNM stage (P<0.05).Higher expression of Bcl-2 or/and C-myc were associated with shorter post-operative survival (P<0.05).C-myc expression can be regarded as an independent prognostic factor through Cox proportional hazard model.Conclusions Bcl-2 might be closely related to the occurrence of the HCC,C-myc was associated with the occurrence and development of HCC,and both could evaluate the prognosis independently.Two oncogenes have synergetic relationship in the process of occurrence of HCC.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 HCC;proto-oncogene;gene expression;immunohistochemisty prognosis
原發(fā)性肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異的病變過程。我們擬在蛋白水平初步探討B(tài)cl-2及C-myc基因聯(lián)合表達(dá)與HCC臨床表現(xiàn)特征及預(yù)后之間的關(guān)系。
材料和方法
一、組織來源 收集我科1988年7月至1997年12月間行肝癌根治性切除，術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌，臨床、病理及隨訪資料完整的病例56例。每例存檔石臘標(biāo)本均經(jīng)再次確認(rèn)。癌周組織為距癌緣1.0cm處肝組織。正常肝組織9例取自不可逆腦外傷者。肝癌根治性切除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤與肝組織之間界限尚清楚，②切緣最少與肝實(shí)質(zhì)相距1cm以上，③肝十二指腸韌帶旁無腫大淋巴結(jié)或行肝十二指腸韌帶旁淋巴結(jié)清掃術(shù)。
, 百拇醫(yī)藥 二、一般資料 56例中男46例，女10例，年齡24～70歲，平均48.8歲。術(shù)前均未行放、化療。隨訪期1～8年。臨床TNM分期按UICC(1987)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期20例、Ⅲ期32例、ⅣA期3例、無ⅣB期。肝癌分化按Edmondson肝細(xì)胞癌分級(1956)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級4例、Ⅱ級20例、Ⅲ級26例、Ⅳ級6例。腫瘤最大直徑12mm～20mm(83.16±37.49mm)，合并肝硬化42例(75.00%)，合并鏡下門靜脈癌栓(TTPV)35例(62.50%)。鏡下TTPV評定參照Hsu等[1]的方法。
三、雙重免疫組化酶標(biāo)法(SABC法) 石蠟包埋組織切片4μm厚，常規(guī)脫蠟。0.3%過氧化氫甲醇室溫下10分鐘。PBS液充分沖洗后，浸入10mmol/L、PH6.0檸檬酸緩沖液中，微波修復(fù)10分鐘，自然冷卻。以1∶50正常羊血清封閉20分鐘后，依次加入1∶100鼠抗人Bcl-2單抗(Dake公司)4℃過夜，1∶100生物素化羊抗鼠IgG及SABC復(fù)合物(博士德公司武漢)。DAB顯色。雙蒸水充分沖洗后，入0.1mol/L,H2SO4室溫下沖洗30分鐘。第二次染色以1∶50正常山羊血清為封閉液，1∶250兔抗人C-myc單抗(Oncogene公司)為第一抗體，1∶100生物素化山羊抗兔IgG為第二抗體，AEC顯色，自然曬干后甘油膠封固。以已知Bcl-2、C-myc均強(qiáng)陽性表達(dá)的小細(xì)胞肺癌存檔石蠟切片為陽性對照。分別以PBS液替代第二次染色中第一抗體、第二抗體及SABC復(fù)合物以三次均不出現(xiàn)第二染色(紅)或混合色(紅棕)為陰性對照，即交叉反應(yīng)陰性。
, 百拇醫(yī)藥
四、結(jié)果評價(jià) 以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色染色為Bcl-2陽性，出現(xiàn)紅色染色為C-myc陽性。采用TAS-PLUS全自動圖像分析系統(tǒng)(德國)，以陽性單位(PU)表示染色強(qiáng)度。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，選擇灰度參數(shù)，用公式PU=｜Gα-Gβ｜/Gmax×100計(jì)算出Bcl-2、C-myc染色強(qiáng)度，即PU值。(Gα為切片中所測內(nèi)容的平均灰度，Gβ為切片中的背景灰度，Gmax為最大灰度值)。
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS for window 6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
結(jié)果
一、Bcl-2及C-myc陽性結(jié)果的形態(tài)及分布定位 Bcl-2陽性結(jié)果為棕褐色，定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜處。C-myc陽性染色為紅色顆粒狀，定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞核組織。部分病例切片上Bcl-2及C-myc陽性表達(dá)的細(xì)胞同時(shí)存在，絕大部分定位于不同細(xì)胞，整體上交叉分布，有部分集中趨勢，偶可見同一細(xì)胞上兩癌基因同時(shí)表達(dá)，未見兩癌基因重疊混合染色(棕紅)。陰性對照試驗(yàn)均無陽性信號出現(xiàn)。
, 百拇醫(yī)藥
二、Bcl-2、C-myc在不同肝組織中的定量表達(dá) Bcl-2、C-myc在正常肝組織、癌旁組織及肝癌組織中均有陽性表達(dá)，且表達(dá)量呈遞增趨勢，表現(xiàn)出相當(dāng)一致性，即正常肝組織<癌旁組織<癌組織，每兩者比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。
表1 Bcl-2及C-myc在不同肝組織中的定量表達(dá)
組別
例數(shù)
Bcl-2
C-myc
PU值(
±SD)
, 百拇醫(yī)藥
P值
PU值(±SD)
P值
正常肝組織
9
3.059±0.128
1.547±0.043
癌旁組織
56
8.635±1.384
, 百拇醫(yī)藥
10.585±1.263
肝癌組織
56
21.097±3.460
<0.01*
36.702±4.961
<0.01*
注：為每兩兩比較結(jié)果
三、Bcl-2、C-myc在進(jìn)展期HCC中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)中，Bcl-2及C-myc的表達(dá)量均在有無包膜組中有顯著性差異(P<0.05)，即包膜完整<包膜不完整<無包膜。C-myc在合并肝硬化、鏡下門脈癌栓及高病理分級、高TNM分期組中有較高表達(dá)(P<0.05)，而Bcl-2在以上各組中表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。Bcl-2、C-myc表達(dá)與患者性別、年齡、血清HBsAg及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。
, 百拇醫(yī)藥
表2 Bcl-2及C-myc在HCC中的定量表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
臨床病
理特征
例數(shù)
Bcl-2
C-myc
PU值(±SD)
P值
PU值(±SD)
, 百拇醫(yī)藥
P值
性別
男
46
21.143±2.941
36.527±4.800
女
10
36.527±4.800
>0.05
36.527±4.800
>0.05
, http://www.www.srpcoatings.com 年齡(歲)
<50
29
21.542±3.553
36.517±3.625
≥50
27
20.658±3.010
>0.05
36.928±3.919
>0.05
血清HBsAg
, 百拇醫(yī)藥
+
34
21.286±3.960
37.436±4.628
-
22
21.003±3.157
>0.05
35.917±5.119
>0.05
合并肝硬化
+
, 百拇醫(yī)藥 42
20.843±2.972
37.796±4.082
-
14
21.179±3.645
>0.05
34.625±5.178
<0.05
最大瘤徑(cm)
≤5
14
, 百拇醫(yī)藥 22.167±3.148
36.506±3.064
5～10
32
20.861±2.885
37.113±4.257
>10
10
21.103±3.502
>0.05*
36.682±4.041
>0.05*
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鏡下門脈癌栓
(TTPV)
+
35
21.003±1.287
38.855±5.274
-
21
21.154±3.506
>0.05
34.671±4.169
<0.05
, 百拇醫(yī)藥
包膜
完整
21
19.815±3.151
34.158±3.612
不完整
13
21.774±2.493
36.728±5.014
無
22
22.586±3.544
, 百拇醫(yī)藥
<0.05*
38.995±3.302
<0.05*
病理分級
Ⅰ～Ⅱ
24
21.293±3.457
35.057±3.285
Ⅲ～Ⅳ
32
20.861±2.804
>0.05
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37.962±5.008
<0.05
TNM分期
Ⅰ～Ⅱ
21
20.365±2.180
34.250±4.766
Ⅲ
32
21.119±3.525
37.013±3.994
Ⅳ
, 百拇醫(yī)藥
3
20.838±3.491
>0.05*
38.976±5.183
<0.05*
注：者為每兩兩比較結(jié)果
四、HCC中Bcl-2、C-myc的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系
(一)Bcl-2、C-myc的表達(dá)對預(yù)后的影響 本組實(shí)驗(yàn)測得的進(jìn)展期HCC中Bcl-2平均PU值為21.097±3.460，C-myc為36.702±4.961。分別以21.097和36.702為界分為Bcl-2高、低表達(dá)組及C-myc高、低表達(dá)組，應(yīng)用Kaplan-meier法制作累積生存曲線并經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Bcl-2高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后生存曲線有顯著性差異(P<0.05)，C-myc高表達(dá)組與低表達(dá)組也有顯著性差異(P<0.05)。二者均高表達(dá)預(yù)后極顯著差于兩者均低表達(dá)組(P<0.001)。見圖1，2，3。
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圖1 Bcl-2表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.05)
A：Bcl-2<21.097 B：Bcl≥21.097
圖2 C-myc表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.05)
A：C-myc<36.702 B：C-myc≥36.702
圖3 Bcl-2及C-myc共同表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.001)
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A：Bcl-2<21.097及C-myc<36.702
B：Bcl-2≥21.097及C-myc≥36.702
C：Bcl-2≥21.097或C-myc≥36.702
(二)多因素分析(Cox模型)結(jié)果 將性別、年齡及Bcl-2、C-myc等16項(xiàng)指標(biāo)數(shù)量化后，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果顯示有三項(xiàng)與預(yù)后有關(guān)的獨(dú)立影響因素：腫瘤包膜、C-myc蛋白表達(dá)及鏡下門脈癌栓。各因素標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)均為正數(shù)，即正相關(guān)，表明無腫瘤包膜、C-myc蛋白高表達(dá)、存在鏡下門脈癌栓者預(yù)后較差。見表3。
表3 多因素Cox模型分析結(jié)果
變量名稱
相對危險(xiǎn)
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度(R)
回歸系數(shù)
(b)
標(biāo)準(zhǔn)誤差
(
)
標(biāo)準(zhǔn)回歸
系數(shù)(b′)
WALD
統(tǒng)計(jì)量
P值
腫瘤包膜
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1.2271
1.1255
0.2920
3.0818
14.8578
0.0001
C-myc表達(dá)
1.1218
1.1340
0.4751
3.1081
5.6963
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0.0170
門脈癌栓
1.1028
1.2828
0.5959
3.6067
4.6345
0.0313
方程總X2=53.251;v=3;P<0.001
討論
腫瘤發(fā)生是由于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡間平衡失衡所致。目前已發(fā)現(xiàn)在HCC中有多種癌基因、抑癌基因及凋亡調(diào)控基因的異常表達(dá)[2]。Bcl-2和C-myc基因作為其中的重要代表。Bcl-2原癌基因最初是在B cell淋巴瘤中t(14;18)染色體易位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)的[3]，實(shí)驗(yàn)顯示其為一種抗凋亡基因，很可能與腫瘤的耐藥性及抗放射敏感性有關(guān)。研究表明Bcl-2及其蛋白產(chǎn)物除在淋巴瘤外許多非造血系統(tǒng)良、惡組織中表達(dá)，如肺癌、胃癌、乳腺癌等，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。轉(zhuǎn)基因動物實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)Bcl-2的肝細(xì)胞可免于抗Fas抗體介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)腫瘤發(fā)生[7]。Zhao等研究則認(rèn)為，Bcl-2蛋白只在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)，癌旁不典型增生肝細(xì)胞并不表達(dá)，提示該基因可能與肝細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生無關(guān)[8]。也有學(xué)者認(rèn)為Bcl-2只在膽管細(xì)胞癌中表達(dá)，在肝細(xì)胞癌中不表達(dá)[9]。本組顯示出Bcl-2蛋白表達(dá)在正常肝組織、癌旁組織及肝癌組織中具有顯著性差異，在肝癌組織中的高表達(dá)強(qiáng)烈提示該基因?qū)CC發(fā)生可能起促進(jìn)作用。但在進(jìn)展期HCC中，Bcl-2蛋白表達(dá)僅在無包膜的腫瘤組織中陽性率較高外，與腫瘤大小、門脈癌栓及病理分級，TNM分期無關(guān)，表明Bcl-2基因?qū)CC的發(fā)展及晚期肝癌的形成似不起決定作用。與多數(shù)在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果有較大差別。我們認(rèn)為并不是所有的程序化死亡都可用Bcl-2來阻止，可能還有獨(dú)立于Bcl-2的其它引起細(xì)胞凋亡的途徑和因素[10]。這尚需進(jìn)行更加深入的研究。
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C-myc基因是較早發(fā)現(xiàn)并研究的癌基因之一，其定位于人染色體8q24，編碼的核內(nèi)轉(zhuǎn)化蛋白P62對正常細(xì)胞生長和分化起重要調(diào)節(jié)作用。該基因除具有刺激細(xì)胞增生的功能外，還具有促進(jìn)凋亡的作用，這種相互對立的作用依賴于關(guān)鍵性生長因子的存在與否[11]。在HCC研究中，C-myc基因異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但許多研究者所得結(jié)論并不完全一致。本組實(shí)驗(yàn)表明在HCC癌組織及癌周組織中，C-myc陽性表達(dá)水平有顯著性升高(P<0.05)，顯示該基因活化發(fā)生在肝癌早期，支持C-myc癌基因的激活可能參與肝細(xì)胞癌變的機(jī)理。Tiniako等研究認(rèn)為肝癌組織中C-myc蛋白表達(dá)增加與肝病背景密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)支持此觀點(diǎn)，在伴有肝硬化組中C-myc蛋白表達(dá)水平顯著增高，肝硬化組織由于肝細(xì)胞反復(fù)再生，使突變機(jī)會上升，癌基因變異水平增加，致癌變發(fā)生發(fā)展。HBV是肝癌的主要病因之一，在人肝癌和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)有HBV DNA整合[16]，在土撥鼠肝炎病毒(WHV)誘發(fā)土撥鼠肝癌常�？梢姴《净蚱握显趍yc基因的調(diào)控區(qū)。本實(shí)驗(yàn)選取患者外周血HBsAg，與肝組織檢測有一定差別，表明外周血HBsAg陽性、陰性患者其肝癌組織C-myc表達(dá)量無顯著性差異。在HCC中，C-myc在具有門脈癌栓、無腫瘤包膜、較低分化及高TNM分期者具有較高的C-myc表達(dá)水平，與大多數(shù)研究相同，同時(shí)也表明C-myc基因的異�；罨贖CC發(fā)展過程中可能是決定因素之一。
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Bcl-2與C-myc共同表達(dá)可使腫瘤獲得永生化[17]。本實(shí)驗(yàn)Bcl-2、C-myc在正常肝組織、癌周組織及癌組織中相伴存在，表達(dá)平行增高，在多數(shù)組織中的分布有較強(qiáng)一致性，顯示兩者在致癌的啟動和演變過程中可能具有協(xié)同作用。Bcl-2做為C-myc基因關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一，不但可阻斷C-myc所誘導(dǎo)的凋亡而不影響其絲裂原活性，它自身所具有的抗凋亡機(jī)制在腫瘤發(fā)生中也發(fā)揮很大作用[18]。雙重免疫組化染色顯示Bcl-2及C-myc癌基因蛋白陽性染色大部分定位于不同細(xì)胞，整體上交叉分布，部分聚集。也可見同一細(xì)胞內(nèi)二者同時(shí)表達(dá)。從其分布可推想癌基因在致癌因子的作用下，大部分分別在不同的細(xì)胞中發(fā)生變異，經(jīng)不同途徑發(fā)揮作用并通過某種中介達(dá)到協(xié)同致癌目的。同一細(xì)胞兩癌基因同時(shí)發(fā)生變異，其致癌機(jī)理可能有所不同。
單因素分析可看到Bcl-2和/或C-myc高表達(dá)與HCC預(yù)后不良有關(guān)，兩者共同高表達(dá)與共同低表達(dá)之間預(yù)后差異更加顯著(P<0.001)。由圖3可見遠(yuǎn)期生存曲線間有部分交叉現(xiàn)象，可能與長期隨訪病例較少有關(guān)。多因素分析則顯示C-myc可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，其高表達(dá)者具有高死亡率，對預(yù)后作用的強(qiáng)度僅次于“有無門脈癌栓”。而Bcl-2尚不能作為一個(gè)獨(dú)立的指標(biāo)來準(zhǔn)確判斷預(yù)后，需與其它多項(xiàng)指標(biāo)綜合分析才更加準(zhǔn)確可靠，兩基因聯(lián)合檢測可提高其預(yù)后判斷價(jià)值。
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癌周組織中Bcl-2、C-myc基因表達(dá)均較正常肝組織有顯著增高，這些近似“正常細(xì)胞”雖然在細(xì)胞形態(tài)上尚未出現(xiàn)改變，實(shí)際已處于致癌因子作用下，基因水平已非完全正常，并具備較高的潛在致癌狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所選距腫瘤1cm處的癌周組織顯然已不能滿足根治要求。
作者簡介：李華(1969-)，男，陜西西安人，博士，主治醫(yī)師，從事肝膽外科，腫瘤外科專業(yè)。
參考文獻(xiàn)
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收稿日期：1999-4-20, 百拇醫(yī)藥
單位：李華(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；潘承恩(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；劉青光(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；于良(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)；馬清涌(西安醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科，西安 710061)
關(guān)鍵詞：肝細(xì)胞癌；原癌基因；基因表達(dá)；免疫組織化學(xué)；預(yù)后
肝細(xì)胞癌中Bcl 〔摘要〕 目的 探討B(tài)cl-2及C-myc蛋白表達(dá)與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后之間的關(guān)系，以及兩者可能具有的協(xié)同性。方法 應(yīng)用免疫組化雙標(biāo)記法(SABC)檢測肝癌組織、癌周組織及正常肝組織中兩者的表達(dá)，并用圖像分析系統(tǒng)加以定量分析。結(jié)果 Bcl-2在三種組織中的表達(dá)量(PU值)分別為21.097±3.460、8.635±1.384、3.059±0.128，C-myc分別為36.702±4.961、10.585±1.263、1.547±0.043，均具顯著性差異(P<0.01)。在肝細(xì)胞癌無腫瘤被膜組中具有高Bcl-2表達(dá)(P<0.05)，而在肝硬化、具有門脈癌栓、無腫瘤被膜、高病理分級及高TNM分期者中具有高C-myc表達(dá)(P<0.05)。高Bcl-2或/和C-myc表達(dá)均與較差預(yù)后有關(guān)(P<0.05)，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型回歸分析可知C-myc為一獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。結(jié)論 Bcl-2與肝細(xì)胞癌發(fā)生有關(guān)，C-myc與肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并可獨(dú)立判斷預(yù)后。兩癌基因具有一定協(xié)同致癌性。
, 百拇醫(yī)藥
〔中圖分類號〕 R730.45；R735.7 〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕B
Expression of Bcl-2、C-myc protein in hepatocellular carcinoma and its relation with the prognosis
LI Hua, PAN Cheng-en, LIU Qing-guang,et al.
(Department of Hepatobiliary Surgery,The First Clinical Medical College,Xi′an Medical University,Xi′an 710061)
〔Abstract〕 Objective To evaluate the effect of the expression of Bcl-2、C-myc protein in the oncogenesis、development and prognosis in hepatocellular carcinoma(HCC),and the correlation of the two oncogenes.Methods Immunohistochemical double staining technique(SABC) was used to detect the expression of the two genes in HCC tissues、liver tissues adjacent to cancer and normal liver tissues,which was also quantitatively analysed by the image system.Results The positive unit(PU)of Bcl-2 protein in three kinds of tissues were 21.097±3.460,8.635±1.384,3.059±0.128 respectively,(P<0.01);the PU of C-myc were 36.702±4.961,10.585±1.263,1.547±0.043, respectively (P<0.01).Expression of Bcl-2 in tumor without capsule was significantly higher than that in the control(P<0.05).The higher positive-staining expression of C-myc were found in the case of cirrhosis and tumor thrombi in the portal vein (TTPV),as well as in the case of tumor without capsule,with higher pathological grade and higher TNM stage (P<0.05).Higher expression of Bcl-2 or/and C-myc were associated with shorter post-operative survival (P<0.05).C-myc expression can be regarded as an independent prognostic factor through Cox proportional hazard model.Conclusions Bcl-2 might be closely related to the occurrence of the HCC,C-myc was associated with the occurrence and development of HCC,and both could evaluate the prognosis independently.Two oncogenes have synergetic relationship in the process of occurrence of HCC.
, 百拇醫(yī)藥
〔Key words〕 HCC;proto-oncogene;gene expression;immunohistochemisty prognosis
原發(fā)性肝癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異的病變過程。我們擬在蛋白水平初步探討B(tài)cl-2及C-myc基因聯(lián)合表達(dá)與HCC臨床表現(xiàn)特征及預(yù)后之間的關(guān)系。
材料和方法
一、組織來源 收集我科1988年7月至1997年12月間行肝癌根治性切除，術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞癌，臨床、病理及隨訪資料完整的病例56例。每例存檔石臘標(biāo)本均經(jīng)再次確認(rèn)。癌周組織為距癌緣1.0cm處肝組織。正常肝組織9例取自不可逆腦外傷者。肝癌根治性切除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤與肝組織之間界限尚清楚，②切緣最少與肝實(shí)質(zhì)相距1cm以上，③肝十二指腸韌帶旁無腫大淋巴結(jié)或行肝十二指腸韌帶旁淋巴結(jié)清掃術(shù)。
, 百拇醫(yī)藥 二、一般資料 56例中男46例，女10例，年齡24～70歲，平均48.8歲。術(shù)前均未行放、化療。隨訪期1～8年。臨床TNM分期按UICC(1987)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期1例、Ⅱ期20例、Ⅲ期32例、ⅣA期3例、無ⅣB期。肝癌分化按Edmondson肝細(xì)胞癌分級(1956)標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ級4例、Ⅱ級20例、Ⅲ級26例、Ⅳ級6例。腫瘤最大直徑12mm～20mm(83.16±37.49mm)，合并肝硬化42例(75.00%)，合并鏡下門靜脈癌栓(TTPV)35例(62.50%)。鏡下TTPV評定參照Hsu等[1]的方法。
三、雙重免疫組化酶標(biāo)法(SABC法) 石蠟包埋組織切片4μm厚，常規(guī)脫蠟。0.3%過氧化氫甲醇室溫下10分鐘。PBS液充分沖洗后，浸入10mmol/L、PH6.0檸檬酸緩沖液中，微波修復(fù)10分鐘，自然冷卻。以1∶50正常羊血清封閉20分鐘后，依次加入1∶100鼠抗人Bcl-2單抗(Dake公司)4℃過夜，1∶100生物素化羊抗鼠IgG及SABC復(fù)合物(博士德公司武漢)。DAB顯色。雙蒸水充分沖洗后，入0.1mol/L,H2SO4室溫下沖洗30分鐘。第二次染色以1∶50正常山羊血清為封閉液，1∶250兔抗人C-myc單抗(Oncogene公司)為第一抗體，1∶100生物素化山羊抗兔IgG為第二抗體，AEC顯色，自然曬干后甘油膠封固。以已知Bcl-2、C-myc均強(qiáng)陽性表達(dá)的小細(xì)胞肺癌存檔石蠟切片為陽性對照。分別以PBS液替代第二次染色中第一抗體、第二抗體及SABC復(fù)合物以三次均不出現(xiàn)第二染色(紅)或混合色(紅棕)為陰性對照，即交叉反應(yīng)陰性。
, 百拇醫(yī)藥
四、結(jié)果評價(jià) 以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色染色為Bcl-2陽性，出現(xiàn)紅色染色為C-myc陽性。采用TAS-PLUS全自動圖像分析系統(tǒng)(德國)，以陽性單位(PU)表示染色強(qiáng)度。隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，選擇灰度參數(shù)，用公式PU=｜Gα-Gβ｜/Gmax×100計(jì)算出Bcl-2、C-myc染色強(qiáng)度，即PU值。(Gα為切片中所測內(nèi)容的平均灰度，Gβ為切片中的背景灰度，Gmax為最大灰度值)。
五、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS for window 6.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。
結(jié)果
一、Bcl-2及C-myc陽性結(jié)果的形態(tài)及分布定位 Bcl-2陽性結(jié)果為棕褐色，定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞漿和/或細(xì)胞膜處。C-myc陽性染色為紅色顆粒狀，定位于肝細(xì)胞的細(xì)胞核組織。部分病例切片上Bcl-2及C-myc陽性表達(dá)的細(xì)胞同時(shí)存在，絕大部分定位于不同細(xì)胞，整體上交叉分布，有部分集中趨勢，偶可見同一細(xì)胞上兩癌基因同時(shí)表達(dá)，未見兩癌基因重疊混合染色(棕紅)。陰性對照試驗(yàn)均無陽性信號出現(xiàn)。
, 百拇醫(yī)藥
二、Bcl-2、C-myc在不同肝組織中的定量表達(dá) Bcl-2、C-myc在正常肝組織、癌旁組織及肝癌組織中均有陽性表達(dá)，且表達(dá)量呈遞增趨勢，表現(xiàn)出相當(dāng)一致性，即正常肝組織<癌旁組織<癌組織，每兩者比較有顯著性差異(P<0.01)。見表1。
表1 Bcl-2及C-myc在不同肝組織中的定量表達(dá)
組別
例數(shù)
Bcl-2
C-myc
PU值(
±SD), 百拇醫(yī)藥
P值
PU值(
±SD)P值
正常肝組織
9
3.059±0.128
1.547±0.043
癌旁組織
56
8.635±1.384
, 百拇醫(yī)藥
10.585±1.263
肝癌組織
56
21.097±3.460
<0.01*
36.702±4.961
<0.01*
注：為每兩兩比較結(jié)果
三、Bcl-2、C-myc在進(jìn)展期HCC中的表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)中，Bcl-2及C-myc的表達(dá)量均在有無包膜組中有顯著性差異(P<0.05)，即包膜完整<包膜不完整<無包膜。C-myc在合并肝硬化、鏡下門脈癌栓及高病理分級、高TNM分期組中有較高表達(dá)(P<0.05)，而Bcl-2在以上各組中表達(dá)無顯著性差異(P>0.05)。Bcl-2、C-myc表達(dá)與患者性別、年齡、血清HBsAg及腫瘤大小無關(guān)(P>0.05)。見表2。
, 百拇醫(yī)藥
表2 Bcl-2及C-myc在HCC中的定量表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
臨床病
理特征
例數(shù)
Bcl-2
C-myc
PU值(
±SD)P值
PU值(
±SD), 百拇醫(yī)藥
P值
性別
男
46
21.143±2.941
36.527±4.800
女
10
36.527±4.800
>0.05
36.527±4.800
>0.05
, http://www.www.srpcoatings.com 年齡(歲)
<50
29
21.542±3.553
36.517±3.625
≥50
27
20.658±3.010
>0.05
36.928±3.919
>0.05
血清HBsAg
, 百拇醫(yī)藥
+
34
21.286±3.960
37.436±4.628
-
22
21.003±3.157
>0.05
35.917±5.119
>0.05
合并肝硬化
+
, 百拇醫(yī)藥 42
20.843±2.972
37.796±4.082
-
14
21.179±3.645
>0.05
34.625±5.178
<0.05
最大瘤徑(cm)
≤5
14
, 百拇醫(yī)藥 22.167±3.148
36.506±3.064
5～10
32
20.861±2.885
37.113±4.257
>10
10
21.103±3.502
>0.05*
36.682±4.041
>0.05*
, http://www.www.srpcoatings.com
鏡下門脈癌栓
(TTPV)
+
35
21.003±1.287
38.855±5.274
-
21
21.154±3.506
>0.05
34.671±4.169
<0.05
, 百拇醫(yī)藥
包膜
完整
21
19.815±3.151
34.158±3.612
不完整
13
21.774±2.493
36.728±5.014
無
22
22.586±3.544
, 百拇醫(yī)藥
<0.05*
38.995±3.302
<0.05*
病理分級
Ⅰ～Ⅱ
24
21.293±3.457
35.057±3.285
Ⅲ～Ⅳ
32
20.861±2.804
>0.05
, http://www.www.srpcoatings.com
37.962±5.008
<0.05
TNM分期
Ⅰ～Ⅱ
21
20.365±2.180
34.250±4.766
Ⅲ
32
21.119±3.525
37.013±3.994
Ⅳ
, 百拇醫(yī)藥
3
20.838±3.491
>0.05*
38.976±5.183
<0.05*
注：者為每兩兩比較結(jié)果
四、HCC中Bcl-2、C-myc的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系
(一)Bcl-2、C-myc的表達(dá)對預(yù)后的影響 本組實(shí)驗(yàn)測得的進(jìn)展期HCC中Bcl-2平均PU值為21.097±3.460，C-myc為36.702±4.961。分別以21.097和36.702為界分為Bcl-2高、低表達(dá)組及C-myc高、低表達(dá)組，應(yīng)用Kaplan-meier法制作累積生存曲線并經(jīng)log-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Bcl-2高表達(dá)組與低表達(dá)組術(shù)后生存曲線有顯著性差異(P<0.05)，C-myc高表達(dá)組與低表達(dá)組也有顯著性差異(P<0.05)。二者均高表達(dá)預(yù)后極顯著差于兩者均低表達(dá)組(P<0.001)。見圖1，2，3。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 Bcl-2表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.05)
A：Bcl-2<21.097 B：Bcl≥21.097
圖2 C-myc表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.05)
A：C-myc<36.702 B：C-myc≥36.702
圖3 Bcl-2及C-myc共同表達(dá)對HCC預(yù)后的影響(P<0.001)
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A：Bcl-2<21.097及C-myc<36.702
B：Bcl-2≥21.097及C-myc≥36.702
C：Bcl-2≥21.097或C-myc≥36.702
(二)多因素分析(Cox模型)結(jié)果 將性別、年齡及Bcl-2、C-myc等16項(xiàng)指標(biāo)數(shù)量化后，經(jīng)Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析，結(jié)果顯示有三項(xiàng)與預(yù)后有關(guān)的獨(dú)立影響因素：腫瘤包膜、C-myc蛋白表達(dá)及鏡下門脈癌栓。各因素標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)均為正數(shù)，即正相關(guān)，表明無腫瘤包膜、C-myc蛋白高表達(dá)、存在鏡下門脈癌栓者預(yù)后較差。見表3。
表3 多因素Cox模型分析結(jié)果
變量名稱
相對危險(xiǎn)
, 百拇醫(yī)藥
度(R)
回歸系數(shù)
(b)
標(biāo)準(zhǔn)誤差
(
)標(biāo)準(zhǔn)回歸
系數(shù)(b′)
WALD
統(tǒng)計(jì)量
P值
腫瘤包膜
, 百拇醫(yī)藥
1.2271
1.1255
0.2920
3.0818
14.8578
0.0001
C-myc表達(dá)
1.1218
1.1340
0.4751
3.1081
5.6963
, http://www.www.srpcoatings.com
0.0170
門脈癌栓
1.1028
1.2828
0.5959
3.6067
4.6345
0.0313
方程總X2=53.251;v=3;P<0.001
討論
腫瘤發(fā)生是由于細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡間平衡失衡所致。目前已發(fā)現(xiàn)在HCC中有多種癌基因、抑癌基因及凋亡調(diào)控基因的異常表達(dá)[2]。Bcl-2和C-myc基因作為其中的重要代表。Bcl-2原癌基因最初是在B cell淋巴瘤中t(14;18)染色體易位點(diǎn)處發(fā)現(xiàn)的[3]，實(shí)驗(yàn)顯示其為一種抗凋亡基因，很可能與腫瘤的耐藥性及抗放射敏感性有關(guān)。研究表明Bcl-2及其蛋白產(chǎn)物除在淋巴瘤外許多非造血系統(tǒng)良、惡組織中表達(dá)，如肺癌、胃癌、乳腺癌等，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[4]。轉(zhuǎn)基因動物實(shí)驗(yàn)表明，表達(dá)Bcl-2的肝細(xì)胞可免于抗Fas抗體介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡，從而誘發(fā)腫瘤發(fā)生[7]。Zhao等研究則認(rèn)為，Bcl-2蛋白只在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)，癌旁不典型增生肝細(xì)胞并不表達(dá)，提示該基因可能與肝細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生無關(guān)[8]。也有學(xué)者認(rèn)為Bcl-2只在膽管細(xì)胞癌中表達(dá)，在肝細(xì)胞癌中不表達(dá)[9]。本組顯示出Bcl-2蛋白表達(dá)在正常肝組織、癌旁組織及肝癌組織中具有顯著性差異，在肝癌組織中的高表達(dá)強(qiáng)烈提示該基因?qū)CC發(fā)生可能起促進(jìn)作用。但在進(jìn)展期HCC中，Bcl-2蛋白表達(dá)僅在無包膜的腫瘤組織中陽性率較高外，與腫瘤大小、門脈癌栓及病理分級，TNM分期無關(guān)，表明Bcl-2基因?qū)CC的發(fā)展及晚期肝癌的形成似不起決定作用。與多數(shù)在其他惡性腫瘤中的研究結(jié)果有較大差別。我們認(rèn)為并不是所有的程序化死亡都可用Bcl-2來阻止，可能還有獨(dú)立于Bcl-2的其它引起細(xì)胞凋亡的途徑和因素[10]。這尚需進(jìn)行更加深入的研究。
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C-myc基因是較早發(fā)現(xiàn)并研究的癌基因之一，其定位于人染色體8q24，編碼的核內(nèi)轉(zhuǎn)化蛋白P62對正常細(xì)胞生長和分化起重要調(diào)節(jié)作用。該基因除具有刺激細(xì)胞增生的功能外，還具有促進(jìn)凋亡的作用，這種相互對立的作用依賴于關(guān)鍵性生長因子的存在與否[11]。在HCC研究中，C-myc基因異常表達(dá)可能與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但許多研究者所得結(jié)論并不完全一致。本組實(shí)驗(yàn)表明在HCC癌組織及癌周組織中，C-myc陽性表達(dá)水平有顯著性升高(P<0.05)，顯示該基因活化發(fā)生在肝癌早期，支持C-myc癌基因的激活可能參與肝細(xì)胞癌變的機(jī)理。Tiniako等研究認(rèn)為肝癌組織中C-myc蛋白表達(dá)增加與肝病背景密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)支持此觀點(diǎn)，在伴有肝硬化組中C-myc蛋白表達(dá)水平顯著增高，肝硬化組織由于肝細(xì)胞反復(fù)再生，使突變機(jī)會上升，癌基因變異水平增加，致癌變發(fā)生發(fā)展。HBV是肝癌的主要病因之一，在人肝癌和癌旁組織中均發(fā)現(xiàn)有HBV DNA整合[16]，在土撥鼠肝炎病毒(WHV)誘發(fā)土撥鼠肝癌常�？梢姴《净蚱握显趍yc基因的調(diào)控區(qū)。本實(shí)驗(yàn)選取患者外周血HBsAg，與肝組織檢測有一定差別，表明外周血HBsAg陽性、陰性患者其肝癌組織C-myc表達(dá)量無顯著性差異。在HCC中，C-myc在具有門脈癌栓、無腫瘤包膜、較低分化及高TNM分期者具有較高的C-myc表達(dá)水平，與大多數(shù)研究相同，同時(shí)也表明C-myc基因的異�；罨贖CC發(fā)展過程中可能是決定因素之一。
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Bcl-2與C-myc共同表達(dá)可使腫瘤獲得永生化[17]。本實(shí)驗(yàn)Bcl-2、C-myc在正常肝組織、癌周組織及癌組織中相伴存在，表達(dá)平行增高，在多數(shù)組織中的分布有較強(qiáng)一致性，顯示兩者在致癌的啟動和演變過程中可能具有協(xié)同作用。Bcl-2做為C-myc基因關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一，不但可阻斷C-myc所誘導(dǎo)的凋亡而不影響其絲裂原活性，它自身所具有的抗凋亡機(jī)制在腫瘤發(fā)生中也發(fā)揮很大作用[18]。雙重免疫組化染色顯示Bcl-2及C-myc癌基因蛋白陽性染色大部分定位于不同細(xì)胞，整體上交叉分布，部分聚集。也可見同一細(xì)胞內(nèi)二者同時(shí)表達(dá)。從其分布可推想癌基因在致癌因子的作用下，大部分分別在不同的細(xì)胞中發(fā)生變異，經(jīng)不同途徑發(fā)揮作用并通過某種中介達(dá)到協(xié)同致癌目的。同一細(xì)胞兩癌基因同時(shí)發(fā)生變異，其致癌機(jī)理可能有所不同。
單因素分析可看到Bcl-2和/或C-myc高表達(dá)與HCC預(yù)后不良有關(guān)，兩者共同高表達(dá)與共同低表達(dá)之間預(yù)后差異更加顯著(P<0.001)。由圖3可見遠(yuǎn)期生存曲線間有部分交叉現(xiàn)象，可能與長期隨訪病例較少有關(guān)。多因素分析則顯示C-myc可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因子，其高表達(dá)者具有高死亡率，對預(yù)后作用的強(qiáng)度僅次于“有無門脈癌栓”。而Bcl-2尚不能作為一個(gè)獨(dú)立的指標(biāo)來準(zhǔn)確判斷預(yù)后，需與其它多項(xiàng)指標(biāo)綜合分析才更加準(zhǔn)確可靠，兩基因聯(lián)合檢測可提高其預(yù)后判斷價(jià)值。
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癌周組織中Bcl-2、C-myc基因表達(dá)均較正常肝組織有顯著增高，這些近似“正常細(xì)胞”雖然在細(xì)胞形態(tài)上尚未出現(xiàn)改變，實(shí)際已處于致癌因子作用下，基因水平已非完全正常，并具備較高的潛在致癌狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)所選距腫瘤1cm處的癌周組織顯然已不能滿足根治要求。
作者簡介：李華(1969-)，男，陜西西安人，博士，主治醫(yī)師，從事肝膽外科，腫瘤外科專業(yè)。
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收稿日期：1999-4-20, 百拇醫(yī)藥