地塞米松對多發(fā)性硬化細胞因子的影響
作者：朱世津 周文斌 湯新年 楊歡 肖波 謝光潔
單位：朱世津(湖南省常德市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 415003)；湯新年(湖南省常德市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 415003)；周文斌(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)；楊歡(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)；肖波(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)；謝光潔(湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)
關(guān)鍵詞：多發(fā)性硬化；地塞米松；γ-干擾素；白細胞介素-10
腦與神經(jīng)疾病雜志000204 摘 要 目的：多發(fā)性硬化(MS)是一種由Th1細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病， 因而減少T細胞產(chǎn)生γ-干擾素(IFN-γ)或增加白細胞介素-10(IL-10)的產(chǎn)生將會達到治療MS 的目的。 通過計數(shù)分泌細胞因子IFN-γ和IL-10， 檢測多發(fā)性硬化(MS)患者外周血單個核 細胞在地塞米松(Dex)影響下的IFN-γ和IL-10的分泌細胞水平。 方法： 將外周血單個核細胞暴露于中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘素抗原髓鞘堿 性蛋白進行體外短時間培養(yǎng)， 然后用Dex作對比試驗， 用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISPOT)檢測 IL-10和IFN-γ分泌細胞， 同時檢測其它神經(jīng)病組(OND)及健康對照組。 結(jié)果： 顯示MS患者IFN-γ分泌細胞水平高于對照組， Dex使MS患者 IFN-γ分泌細胞減少， 對IL-10分泌細胞無明顯影響。 結(jié)論： MS患者存在Th1/Th2細胞因子的失衡， Dex能抑制MS Th1類 細胞因子IFN-γ， 恢復(fù)其兩類細胞因子之間的平衡而對MS患者產(chǎn)生治療作用。
, 百拇醫(yī)藥
Effect of Dexamethone in vitro on immune functions in mult iple sclerosis
Zhu Shijin, Zhou Wenbin, Tang Xinnian, et al
Department of Neurology, The first Hospital of Changde City, Hunan. 415003
Abstract Objective： Multiple sclerosis (MS) is postulated to be a Th1- type cell-mediated autoimmune disease. Thus therapies that dectease Tcell interf eron (IFN)-γ production or increase interleukin (IL)-10 production would be e xpected to have an ameliorating effect on MS. High doses of glucocorticoids (GCs ) are widely employed to treat acute attacks in MS patients. Their beneficial eff e cts are partially due to their capacity ot regulate the cytokine network. In th e present work, we have examined the effect of GCs on the production of the immu nosuppressor cytokine IL-10 and the inflammatory cytokine IFN-γ. Methods: Blood samples from MS patients suffering an acute rel apse were obtained, Levels of IL-10 and IFN-γ secreting cells in PBMC were dete rmined by ILISPOT, The expressions of IL-10 and IFN-γ were studied in blood MNC of the MS patients after being cultured in the presence of myelin basic protein (MBP), without antigen; in the presence of Dexamethsone, without drug.Results: In vitro experiments employing normal PBMC showed tha t Dexamethsone downregulated both MBP induced-IFN-γ and spontaneous expression of IFN-γ no effect on IL-10 secreting cells was found. Conclusion: In summary, our results demonstrate a Th1-type cyt okine bias in peripheral blood mononuclear cells of untreated MS patients that i s reversed by Dex treatment. These findings provide a basis for immune monitorin g of patients with MS and suggest tha treaments downregulate IFN-γ may prove to be beneficial in progressive MS.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Multiple sclerosis Dexamethsone Interferon-γ Interleukin-10
多發(fā)性硬化(MS)是一種由CD4+細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)的自身免疫性 疾病， 以CNS的炎性脫髓鞘和小血管旁單個核炎性細胞浸潤為特征[1，2]。 近年 來， 對其發(fā)病機制研究進展較快， 很多作者認(rèn)為CD4+細胞分泌的細胞因子在其發(fā)病中起 重要作用。 CD4+細胞可產(chǎn)生兩種細胞因子： 即炎性細胞因子(Th1 cytoking, ck)， 其可 以γ-干擾素(IFN-γ)為代表； 和調(diào)節(jié)因子(Th2)， 其可以白細胞介素-10(IL-10)為代表。 在正常情況下， Th1/Th2細胞因子互相拮抗處于相對平衡， 機體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài)。 病 理情況時， 二者平衡被打破， Th1細胞因子水平上升， Th2細胞因子水平下降， 則導(dǎo)致細 胞 免疫介導(dǎo)的炎性疾病發(fā)生。 通過免疫調(diào)節(jié)劑增強Th2 CK 的抑制作用或抑制炎性CK， 來恢 復(fù)Th1和Th2之間的平衡似乎是一種可能的治療途徑[3]。
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可的松類藥物是非常有效的免疫抑制劑， 廣泛的用于治療各種自身免疫性炎性疾病 [4]。 地塞米松(Dex)用于治療MS在急性期和預(yù)防復(fù)發(fā)方面都有明顯的效果， 但作用機 制尚不十分清楚。 為了解Dex對IFN-γ和IL-10的影響， 我們應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISP OT)的技術(shù)， 從單個核細胞(MNC)水平， 在自發(fā)和暴露于髓鞘抗原髓鞘堿性蛋白(MBP)刺激 下， 分別加用Dex和不用Dex進行實驗，檢測了MS患者外周血單個核細胞IFN-γ和IL-10分泌 細胞。
資 料 和 方 法
臨床資料
MS患者組： 21例均為湘雅醫(yī)院1997年9月至1999年2月門診及住院患者， 其中男性8例， 女性13例。 臨床診斷為MS[5]， 年齡為18～60歲， 平均年齡39歲； 病程為0.5～ 20年， 平均10年； 9例患者無或僅留輕度功能缺損， 其余有中度或嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損 。 所有受試者在采取標(biāo)本前6個月內(nèi)均未使用包括激素在內(nèi)的免疫抑制劑。
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其它神經(jīng)病組(OND)： 18例， 其中男性8例， 女性10例， 年齡38～70歲， 平均年齡55 歲。 腦梗死2例， 病毒性腦膜炎2例， 肌緊張性頭痛6例， 多發(fā)性神經(jīng)病3例， 單發(fā)性神 經(jīng)病2例， 面肌痙攣2例， 三叉神經(jīng)痛1例。
健康對照組(HC)： 12名身體健康的醫(yī)院工作人員。
標(biāo)本處理： 外周血(PB)， 10ml加等量Iscovel培養(yǎng)液混勻后， 經(jīng)用淋巴細胞分層進行密 度梯度離心分離MNC， 再用Dulbeco培養(yǎng)液洗滌離心3次， 用加有抗生素的FCS的Iscovel培 養(yǎng)液懸， 調(diào)整MNC至109/L。
抗原制備： MBP自牛腦髓鞘素中提取， 經(jīng)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SPS- PAGE)純化， 顯示相對分子質(zhì)量為24萬的單一條帶[6]。
, 百拇醫(yī)藥 IFN-γ分泌細胞檢測： 采用ELISPOT技術(shù)從單個核細胞水平檢測IFN-γ分泌細胞。 所有 試劑盒 為MABTECHAB公司生產(chǎn)(Sweden)， 使用濃度度為15mg/L小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體1 00μl包被于96孔硝酸纖維膜微量板(Millititre, Bedford, MA.USA)4℃過夜， 用碳酸緩沖 生理鹽水(PBS)， 經(jīng)0.45μm直徑濾膜濾過(下同)， 洗板6次， 每孔加入200μl含有2 ×1 05PBMNC， 取2復(fù)孔， 每復(fù)孔再加終濃度為10ml/L刺激抗原MBP， 及不加抗原的0對照(0A g)； 同時， 每孔加Dex， 或不加Dex的對照(0Drug)。 微量板置37℃、 7%CO2孵育箱48小 時， 棄上清， 用PH7.4的PBS洗板6次。 加入免抗入單克隆IFN-γ抗體， 濃度為1mg/L， 每孔100μμl， 室溫下孵育2小時， 洗板6次， 每孔加100μl SAP， 稀釋度為1∶1000， 室溫下孵育1小時， 洗板6次后， 加100μ lBCIP/NBT(BioRad.Richmond.USA)室溫下孵育1 5 ～30分鐘， 出現(xiàn)藍黑點后流水洗板終止反應(yīng)。 由不知道受檢內(nèi)容的臨床診斷者負責(zé)在顯微 鏡下讀板(倍數(shù)為×25)， 結(jié)果表示為IFN-γ分泌細胞數(shù)105MNC， 統(tǒng)計學(xué)分析采用Man-Wh iteU檢驗。
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IL-10分泌細胞檢測， 方法同上。
結(jié) 果
1. Dex對自發(fā)性IFN-γ分泌細胞的影響， 在MS組外周血中， 自發(fā)性IFN-γ分 泌細胞明顯增多。 Dex影響后IFN-γ分泌細胞明顯減少， 兩者相比有顯著性差異； OND和 HC組上述條件下相比差異無顯著意義(表1)。
表1 地塞米松對MS、 OND及HC組外周血單個核細 胞的IFN-γ分泌細胞數(shù)的影響(x±s分泌細胞數(shù)/105MNC)
例數(shù)
MBP
0Ag
0Drug
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Dex
0Drug
Dex
MS
21
23.5±15.7
7.4±3.8
12.3±9.7
3.3±1.2
OND
18
3.2±2.7
3.7±2.8
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2.1±1.9
2.3±2.7
HC
12
1.3±1.1
1.5±1.7
1.0±0.9
2.1±1.3
P
<0.001
<0.01
0Ag無任何抗原條件下， 0Drug無任何藥物條件下， Dex地塞米松， P 值為Dex組與0Drug組比較， 下表同。
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2. Dex對抗原刺激下的IFN-γ分泌細胞的影響， 在MS組PBL中， IFN-γ分泌細胞在MBP刺 激下明顯增加， 在Dex影響后， 同樣刺激下IFN-γ分泌細胞增加明顯減少， 兩者相比有高 度顯著差異， OND和HC組未發(fā)現(xiàn)明顯差異(表1)。
3. Dex對IL-10分泌細胞的影響， 在所有MS、 OND和HC組的PBL中發(fā)現(xiàn)有分IL-10泌細胞 ， 在MS組無抗原刺激下， Dex均能使IL-10分泌細胞增加， 但與未加Dex條件下相比差異 無顯著性意義(表2)。
表2 地塞米松對MS、OND及HC組外周血單個核細 胞IL-10細胞數(shù)的影響(x±s， 分泌細胞數(shù)/105 MNC)
例數(shù)
MBP
0Ag
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0Drug
Dex
0Drug
Dex
MS
21
4.2±6.8
45±3.5
19±3.8
22.2±4.6
OND
18
28±3.5
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27±5.7
24±3.3
21±6.9
HC
12
27±1.9
22±2.4
23±2.1
25±6.5
討 論
MS患者病灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細胞浸潤， 炎性細胞自循環(huán)進入病灶內(nèi)的過程 受到細胞因子的調(diào)節(jié)。 對MS患者隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或惡化多在感染后發(fā)生， 感染后的IFN-γ水 平增高可能是誘發(fā)MS的主要因素之一[7]。 IFN-γ屬于Th1類細胞因子， 參與免疫 應(yīng)答及炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)階段， 主要來源于活化的單核巨噬細胞。 其可促進人類組織主要相 容性抗原-Ⅱ(MHC-Ⅱ)在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍血中單核巨噬細胞的表達、 加強 抗原的呈遞、 促進T細胞的活化、 和上調(diào)粘附分子在血管內(nèi)皮細胞的表達， 總之， 在啟 動MS發(fā)作中起到中心的作用。 有作者觀察到， 在MS的急性期， IFN-γ的產(chǎn)生明顯增加， 肌注重組IFN-γ可加重MS的病情[8]。 本研究結(jié)果也顯示， MS患者IFN-γ分泌細 胞高于0ND組和正常對照組， 表明循環(huán)中活化巨噬細胞與MS復(fù)發(fā)或急性發(fā)作有關(guān)。 提示對 抗IFN-γ的作用可能改善MS的病情[5]。 本組對MS患者的IFN-γ分泌細胞進行對比 檢查發(fā)現(xiàn)， MS患者的IFN-γ分泌細胞受Dex的影響， Dex對MS的IFN-γ分泌細胞有抑制作用 ， 特別是對抗原刺激下IFN-γ分泌細胞增多時有明顯的抑制作用， 所以臨床上Dex治療MS 的急性期和復(fù)發(fā)時療效明顯， 推測Dex可能是通過減少周圍血IFN-γ的合成， 抑制IFN-γ 誘導(dǎo)的HLADR的表達， 拮抗IFN-γ的免疫激活作用而達到對MS的保護作用。
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糖皮質(zhì)激素可通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能。 在MS， 其能抑制T細胞的增殖及功能而產(chǎn)生 抗炎的活性作用。 固醇類藥物可抑制促炎性細胞因子IL-2、 IFN-γ、 TNF-α和IL-1。 另 外， 地塞米松可上調(diào)TGF-β基因的表達， 其為一種抗炎性細胞因子， 可能在MS的緩解過 程中起作用[9]。 MS急性階段的早期， 血腦屏障(BBB)被破壞， 活化淋巴細胞浸 潤進入CNS形成脫髓鞘病灶， 此種現(xiàn)象可被對比-增強的磁共振(MRI)所觀察到。 而MRI發(fā)現(xiàn) ， 在MS的急性發(fā)作期使用固醇類藥物可迅速減輕BBB的破壞。 BBB的修復(fù)可能是通過下調(diào)粘 附分子表達， 從而減少淋巴細胞進入腦實質(zhì)。 固醇類藥物尚可增強毛細血管內(nèi)皮細胞的功 能， 因其能減少基質(zhì)金屬蛋白(MMP)及蛋白解酶的活性， 后者能使血管基膜解體導(dǎo)致BBB破 壞而使MS病灶形成[10]。 糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用還包括誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡、 減少花生四烯酸產(chǎn)物的釋放， 進一步調(diào)節(jié)MS的炎性反應(yīng)[11]。
, http://www.www.srpcoatings.com 目前公認(rèn)糖皮質(zhì)激素可減少單核巨噬細胞的分化并抑制其功能。 這種抑制功能可能是首 先封閉了IFN-γ mRNA的表達和IFN-γ的分泌而實現(xiàn)的。 當(dāng)激素與胞質(zhì)內(nèi)特異性受體結(jié)合后 ， 這些活化的激素-受體復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)。 在細胞核內(nèi)， IFN-γ的合成在轉(zhuǎn)錄及 轉(zhuǎn)錄后水平均受到抑制。 激素-受體復(fù)合物可通過誘導(dǎo)IkBa抑制蛋白的合成而干擾轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB的活性， 從而自動控制選擇性的誘導(dǎo)IFN-γ mRNA的變性[12]。
文獻報道表明， 其他Th1細胞因子如IFN-α、 IL-2、 TNF-α和IL-1等也可顯著地受到固 醇類藥物抑制。 對這些細胞因子合成的抑制也可能發(fā)生在核轉(zhuǎn)錄水平， 因為糖皮質(zhì)激素能 抑 制NF-kB和AP-1的活性， 淋巴因子基因誘導(dǎo)需要轉(zhuǎn)錄因子參與。 另外， TNF-α的活化過程 依賴于金屬蛋白酶的活化， 如上所述， 糖皮質(zhì)激素中抑制金屬蛋白酶的活性[13] 。 TNF-α和IFN-γ一樣， 在MS的炎性病灶形成中起著關(guān)鍵性的作用。
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很久以來人們即觀察到， 治療劑量的糖皮質(zhì)激素使用可以使血中的中性粒細胞數(shù)量明顯 增加。 這是因為糖皮質(zhì)激素受體產(chǎn)生了調(diào)節(jié)和抑制血管內(nèi)皮細胞表面粘附分子的轉(zhuǎn)錄 及表達的作用， 從而減少內(nèi)皮對靜止單個核淋巴細胞的粘附性， 故循環(huán)中淋巴細胞增加。 在MS， 血管內(nèi)皮的改變可增加BBB的通透性， 容許淋巴細胞浸潤進入CNS， 在炎性病灶形 成中起關(guān)鍵性作用。 有作者報道， 在圍繞MS炎性病灶周圍的血管上有粘附分子的表達， 且 通過MRI研究表明， 患者粘附分子水平的高低與病灶的演變有關(guān)[14]。 本研究顯 示IFN-γ分泌細胞在MS患者中明顯增高， 而其已被證明為粘附分子的強烈誘導(dǎo)劑。 因此， 糖皮質(zhì)激素作用于MS的另一個重要機制為調(diào)節(jié)內(nèi)皮對炎性刺激的反應(yīng)。 這也可解釋當(dāng)糖 皮 質(zhì)激素治療MS時， 增強-對比的MRI可觀察到破壞了的BBB迅速得到修復(fù)。 然而， 淋巴細胞 浸 潤進入CNS的被封閉不僅是因為粘附分子的下調(diào)， 也可能是由于糖皮質(zhì)激素干擾了基質(zhì)金屬 蛋白酶的合成。
IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生， 可抑制抗原提呈細胞的功能及T細胞增殖， 抑制Th1細胞分泌 CK， 可下調(diào)IL-1、 IL-2、 IFN-γ、 TNF-α等炎性CK 的產(chǎn)生和單核/巨噬細胞MHCⅡ類復(fù) 合物的表達， 單核/巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的作用亦被強烈抑制[15]， 故IL-10為 重要的免疫調(diào)節(jié)因子。 有報道表明， IL-10與MS病情的緩解或復(fù)發(fā)有密切的關(guān)系， 在其急 性期， IL-10水平處于低值， 而緩解期水平則上升[16]。Gayo等[17]報 道， 可的松類藥物能促進Th1類CK向Th2類CK轉(zhuǎn)化的傾向， 可上調(diào)Th2類CK如IL-10、 IL-4 合成， 與此同時抑制Th1類CK如IFN-γ的分泌。 本組結(jié)果顯示Dex可使IL-10分泌細胞輕度 增加， 但與對照相比無明顯差異， 說明Dex對IL-10分泌細胞無明影響。 由此推測， Dex 通過抑制IFN-γ而使Th1和Th2細胞之間的平衡得到恢復(fù)， 從而抑制炎癥反應(yīng)， 促進髓鞘再 生， BBB修復(fù)達到治療目的。
, 百拇醫(yī)藥
參考文獻
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(1999-09-30 收稿), 百拇醫(yī)藥
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Abstract Objective： Multiple sclerosis (MS) is postulated to be a Th1- type cell-mediated autoimmune disease. Thus therapies that dectease Tcell interf eron (IFN)-γ production or increase interleukin (IL)-10 production would be e xpected to have an ameliorating effect on MS. High doses of glucocorticoids (GCs ) are widely employed to treat acute attacks in MS patients. Their beneficial eff e cts are partially due to their capacity ot regulate the cytokine network. In th e present work, we have examined the effect of GCs on the production of the immu nosuppressor cytokine IL-10 and the inflammatory cytokine IFN-γ. Methods: Blood samples from MS patients suffering an acute rel apse were obtained, Levels of IL-10 and IFN-γ secreting cells in PBMC were dete rmined by ILISPOT, The expressions of IL-10 and IFN-γ were studied in blood MNC of the MS patients after being cultured in the presence of myelin basic protein (MBP), without antigen; in the presence of Dexamethsone, without drug.Results: In vitro experiments employing normal PBMC showed tha t Dexamethsone downregulated both MBP induced-IFN-γ and spontaneous expression of IFN-γ no effect on IL-10 secreting cells was found. Conclusion: In summary, our results demonstrate a Th1-type cyt okine bias in peripheral blood mononuclear cells of untreated MS patients that i s reversed by Dex treatment. These findings provide a basis for immune monitorin g of patients with MS and suggest tha treaments downregulate IFN-γ may prove to be beneficial in progressive MS.
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Key words Multiple sclerosis Dexamethsone Interferon-γ Interleukin-10
多發(fā)性硬化(MS)是一種由CD4+細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)白質(zhì)的自身免疫性 疾病， 以CNS的炎性脫髓鞘和小血管旁單個核炎性細胞浸潤為特征[1，2]。 近年 來， 對其發(fā)病機制研究進展較快， 很多作者認(rèn)為CD4+細胞分泌的細胞因子在其發(fā)病中起 重要作用。 CD4+細胞可產(chǎn)生兩種細胞因子： 即炎性細胞因子(Th1 cytoking, ck)， 其可 以γ-干擾素(IFN-γ)為代表； 和調(diào)節(jié)因子(Th2)， 其可以白細胞介素-10(IL-10)為代表。 在正常情況下， Th1/Th2細胞因子互相拮抗處于相對平衡， 機體處于免疫穩(wěn)定狀態(tài)。 病 理情況時， 二者平衡被打破， Th1細胞因子水平上升， Th2細胞因子水平下降， 則導(dǎo)致細 胞 免疫介導(dǎo)的炎性疾病發(fā)生。 通過免疫調(diào)節(jié)劑增強Th2 CK 的抑制作用或抑制炎性CK， 來恢 復(fù)Th1和Th2之間的平衡似乎是一種可能的治療途徑[3]。
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可的松類藥物是非常有效的免疫抑制劑， 廣泛的用于治療各種自身免疫性炎性疾病 [4]。 地塞米松(Dex)用于治療MS在急性期和預(yù)防復(fù)發(fā)方面都有明顯的效果， 但作用機 制尚不十分清楚。 為了解Dex對IFN-γ和IL-10的影響， 我們應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點試驗(ELISP OT)的技術(shù)， 從單個核細胞(MNC)水平， 在自發(fā)和暴露于髓鞘抗原髓鞘堿性蛋白(MBP)刺激 下， 分別加用Dex和不用Dex進行實驗，檢測了MS患者外周血單個核細胞IFN-γ和IL-10分泌 細胞。
資 料 和 方 法
臨床資料
MS患者組： 21例均為湘雅醫(yī)院1997年9月至1999年2月門診及住院患者， 其中男性8例， 女性13例。 臨床診斷為MS[5]， 年齡為18～60歲， 平均年齡39歲； 病程為0.5～ 20年， 平均10年； 9例患者無或僅留輕度功能缺損， 其余有中度或嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損 。 所有受試者在采取標(biāo)本前6個月內(nèi)均未使用包括激素在內(nèi)的免疫抑制劑。
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其它神經(jīng)病組(OND)： 18例， 其中男性8例， 女性10例， 年齡38～70歲， 平均年齡55 歲。 腦梗死2例， 病毒性腦膜炎2例， 肌緊張性頭痛6例， 多發(fā)性神經(jīng)病3例， 單發(fā)性神 經(jīng)病2例， 面肌痙攣2例， 三叉神經(jīng)痛1例。
健康對照組(HC)： 12名身體健康的醫(yī)院工作人員。
標(biāo)本處理： 外周血(PB)， 10ml加等量Iscovel培養(yǎng)液混勻后， 經(jīng)用淋巴細胞分層進行密 度梯度離心分離MNC， 再用Dulbeco培養(yǎng)液洗滌離心3次， 用加有抗生素的FCS的Iscovel培 養(yǎng)液懸， 調(diào)整MNC至109/L。
抗原制備： MBP自牛腦髓鞘素中提取， 經(jīng)用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SPS- PAGE)純化， 顯示相對分子質(zhì)量為24萬的單一條帶[6]。
, 百拇醫(yī)藥 IFN-γ分泌細胞檢測： 采用ELISPOT技術(shù)從單個核細胞水平檢測IFN-γ分泌細胞。 所有 試劑盒 為MABTECHAB公司生產(chǎn)(Sweden)， 使用濃度度為15mg/L小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體1 00μl包被于96孔硝酸纖維膜微量板(Millititre, Bedford, MA.USA)4℃過夜， 用碳酸緩沖 生理鹽水(PBS)， 經(jīng)0.45μm直徑濾膜濾過(下同)， 洗板6次， 每孔加入200μl含有2 ×1 05PBMNC， 取2復(fù)孔， 每復(fù)孔再加終濃度為10ml/L刺激抗原MBP， 及不加抗原的0對照(0A g)； 同時， 每孔加Dex， 或不加Dex的對照(0Drug)。 微量板置37℃、 7%CO2孵育箱48小 時， 棄上清， 用PH7.4的PBS洗板6次。 加入免抗入單克隆IFN-γ抗體， 濃度為1mg/L， 每孔100μμl， 室溫下孵育2小時， 洗板6次， 每孔加100μl SAP， 稀釋度為1∶1000， 室溫下孵育1小時， 洗板6次后， 加100μ lBCIP/NBT(BioRad.Richmond.USA)室溫下孵育1 5 ～30分鐘， 出現(xiàn)藍黑點后流水洗板終止反應(yīng)。 由不知道受檢內(nèi)容的臨床診斷者負責(zé)在顯微 鏡下讀板(倍數(shù)為×25)， 結(jié)果表示為IFN-γ分泌細胞數(shù)105MNC， 統(tǒng)計學(xué)分析采用Man-Wh iteU檢驗。
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IL-10分泌細胞檢測， 方法同上。
結(jié) 果
1. Dex對自發(fā)性IFN-γ分泌細胞的影響， 在MS組外周血中， 自發(fā)性IFN-γ分 泌細胞明顯增多。 Dex影響后IFN-γ分泌細胞明顯減少， 兩者相比有顯著性差異； OND和 HC組上述條件下相比差異無顯著意義(表1)。
表1 地塞米松對MS、 OND及HC組外周血單個核細 胞的IFN-γ分泌細胞數(shù)的影響(x±s分泌細胞數(shù)/105MNC)
例數(shù)
MBP
0Ag
0Drug
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Dex
0Drug
Dex
MS
21
23.5±15.7
7.4±3.8
12.3±9.7
3.3±1.2
OND
18
3.2±2.7
3.7±2.8
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2.1±1.9
2.3±2.7
HC
12
1.3±1.1
1.5±1.7
1.0±0.9
2.1±1.3
P
<0.001
<0.01
0Ag無任何抗原條件下， 0Drug無任何藥物條件下， Dex地塞米松， P 值為Dex組與0Drug組比較， 下表同。
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2. Dex對抗原刺激下的IFN-γ分泌細胞的影響， 在MS組PBL中， IFN-γ分泌細胞在MBP刺 激下明顯增加， 在Dex影響后， 同樣刺激下IFN-γ分泌細胞增加明顯減少， 兩者相比有高 度顯著差異， OND和HC組未發(fā)現(xiàn)明顯差異(表1)。
3. Dex對IL-10分泌細胞的影響， 在所有MS、 OND和HC組的PBL中發(fā)現(xiàn)有分IL-10泌細胞 ， 在MS組無抗原刺激下， Dex均能使IL-10分泌細胞增加， 但與未加Dex條件下相比差異 無顯著性意義(表2)。
表2 地塞米松對MS、OND及HC組外周血單個核細 胞IL-10細胞數(shù)的影響(x±s， 分泌細胞數(shù)/105 MNC)
例數(shù)
MBP
0Ag
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0Drug
Dex
0Drug
Dex
MS
21
4.2±6.8
45±3.5
19±3.8
22.2±4.6
OND
18
28±3.5
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27±5.7
24±3.3
21±6.9
HC
12
27±1.9
22±2.4
23±2.1
25±6.5
討 論
MS患者病灶內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量的炎性細胞浸潤， 炎性細胞自循環(huán)進入病灶內(nèi)的過程 受到細胞因子的調(diào)節(jié)。 對MS患者隨訪發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)或惡化多在感染后發(fā)生， 感染后的IFN-γ水 平增高可能是誘發(fā)MS的主要因素之一[7]。 IFN-γ屬于Th1類細胞因子， 參與免疫 應(yīng)答及炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)階段， 主要來源于活化的單核巨噬細胞。 其可促進人類組織主要相 容性抗原-Ⅱ(MHC-Ⅱ)在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和周圍血中單核巨噬細胞的表達、 加強 抗原的呈遞、 促進T細胞的活化、 和上調(diào)粘附分子在血管內(nèi)皮細胞的表達， 總之， 在啟 動MS發(fā)作中起到中心的作用。 有作者觀察到， 在MS的急性期， IFN-γ的產(chǎn)生明顯增加， 肌注重組IFN-γ可加重MS的病情[8]。 本研究結(jié)果也顯示， MS患者IFN-γ分泌細 胞高于0ND組和正常對照組， 表明循環(huán)中活化巨噬細胞與MS復(fù)發(fā)或急性發(fā)作有關(guān)。 提示對 抗IFN-γ的作用可能改善MS的病情[5]。 本組對MS患者的IFN-γ分泌細胞進行對比 檢查發(fā)現(xiàn)， MS患者的IFN-γ分泌細胞受Dex的影響， Dex對MS的IFN-γ分泌細胞有抑制作用 ， 特別是對抗原刺激下IFN-γ分泌細胞增多時有明顯的抑制作用， 所以臨床上Dex治療MS 的急性期和復(fù)發(fā)時療效明顯， 推測Dex可能是通過減少周圍血IFN-γ的合成， 抑制IFN-γ 誘導(dǎo)的HLADR的表達， 拮抗IFN-γ的免疫激活作用而達到對MS的保護作用。
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糖皮質(zhì)激素可通過多種途徑調(diào)節(jié)免疫功能。 在MS， 其能抑制T細胞的增殖及功能而產(chǎn)生 抗炎的活性作用。 固醇類藥物可抑制促炎性細胞因子IL-2、 IFN-γ、 TNF-α和IL-1。 另 外， 地塞米松可上調(diào)TGF-β基因的表達， 其為一種抗炎性細胞因子， 可能在MS的緩解過 程中起作用[9]。 MS急性階段的早期， 血腦屏障(BBB)被破壞， 活化淋巴細胞浸 潤進入CNS形成脫髓鞘病灶， 此種現(xiàn)象可被對比-增強的磁共振(MRI)所觀察到。 而MRI發(fā)現(xiàn) ， 在MS的急性發(fā)作期使用固醇類藥物可迅速減輕BBB的破壞。 BBB的修復(fù)可能是通過下調(diào)粘 附分子表達， 從而減少淋巴細胞進入腦實質(zhì)。 固醇類藥物尚可增強毛細血管內(nèi)皮細胞的功 能， 因其能減少基質(zhì)金屬蛋白(MMP)及蛋白解酶的活性， 后者能使血管基膜解體導(dǎo)致BBB破 壞而使MS病灶形成[10]。 糖皮質(zhì)激素的免疫抑制作用還包括誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡、 減少花生四烯酸產(chǎn)物的釋放， 進一步調(diào)節(jié)MS的炎性反應(yīng)[11]。
, http://www.www.srpcoatings.com 目前公認(rèn)糖皮質(zhì)激素可減少單核巨噬細胞的分化并抑制其功能。 這種抑制功能可能是首 先封閉了IFN-γ mRNA的表達和IFN-γ的分泌而實現(xiàn)的。 當(dāng)激素與胞質(zhì)內(nèi)特異性受體結(jié)合后 ， 這些活化的激素-受體復(fù)合物被轉(zhuǎn)運到細胞核內(nèi)。 在細胞核內(nèi)， IFN-γ的合成在轉(zhuǎn)錄及 轉(zhuǎn)錄后水平均受到抑制。 激素-受體復(fù)合物可通過誘導(dǎo)IkBa抑制蛋白的合成而干擾轉(zhuǎn)錄因子 NF-kB的活性， 從而自動控制選擇性的誘導(dǎo)IFN-γ mRNA的變性[12]。
文獻報道表明， 其他Th1細胞因子如IFN-α、 IL-2、 TNF-α和IL-1等也可顯著地受到固 醇類藥物抑制。 對這些細胞因子合成的抑制也可能發(fā)生在核轉(zhuǎn)錄水平， 因為糖皮質(zhì)激素能 抑 制NF-kB和AP-1的活性， 淋巴因子基因誘導(dǎo)需要轉(zhuǎn)錄因子參與。 另外， TNF-α的活化過程 依賴于金屬蛋白酶的活化， 如上所述， 糖皮質(zhì)激素中抑制金屬蛋白酶的活性[13] 。 TNF-α和IFN-γ一樣， 在MS的炎性病灶形成中起著關(guān)鍵性的作用。
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很久以來人們即觀察到， 治療劑量的糖皮質(zhì)激素使用可以使血中的中性粒細胞數(shù)量明顯 增加。 這是因為糖皮質(zhì)激素受體產(chǎn)生了調(diào)節(jié)和抑制血管內(nèi)皮細胞表面粘附分子的轉(zhuǎn)錄 及表達的作用， 從而減少內(nèi)皮對靜止單個核淋巴細胞的粘附性， 故循環(huán)中淋巴細胞增加。 在MS， 血管內(nèi)皮的改變可增加BBB的通透性， 容許淋巴細胞浸潤進入CNS， 在炎性病灶形 成中起關(guān)鍵性作用。 有作者報道， 在圍繞MS炎性病灶周圍的血管上有粘附分子的表達， 且 通過MRI研究表明， 患者粘附分子水平的高低與病灶的演變有關(guān)[14]。 本研究顯 示IFN-γ分泌細胞在MS患者中明顯增高， 而其已被證明為粘附分子的強烈誘導(dǎo)劑。 因此， 糖皮質(zhì)激素作用于MS的另一個重要機制為調(diào)節(jié)內(nèi)皮對炎性刺激的反應(yīng)。 這也可解釋當(dāng)糖 皮 質(zhì)激素治療MS時， 增強-對比的MRI可觀察到破壞了的BBB迅速得到修復(fù)。 然而， 淋巴細胞 浸 潤進入CNS的被封閉不僅是因為粘附分子的下調(diào)， 也可能是由于糖皮質(zhì)激素干擾了基質(zhì)金屬 蛋白酶的合成。
IL-10主要由Th2細胞產(chǎn)生， 可抑制抗原提呈細胞的功能及T細胞增殖， 抑制Th1細胞分泌 CK， 可下調(diào)IL-1、 IL-2、 IFN-γ、 TNF-α等炎性CK 的產(chǎn)生和單核/巨噬細胞MHCⅡ類復(fù) 合物的表達， 單核/巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子的作用亦被強烈抑制[15]， 故IL-10為 重要的免疫調(diào)節(jié)因子。 有報道表明， IL-10與MS病情的緩解或復(fù)發(fā)有密切的關(guān)系， 在其急 性期， IL-10水平處于低值， 而緩解期水平則上升[16]。Gayo等[17]報 道， 可的松類藥物能促進Th1類CK向Th2類CK轉(zhuǎn)化的傾向， 可上調(diào)Th2類CK如IL-10、 IL-4 合成， 與此同時抑制Th1類CK如IFN-γ的分泌。 本組結(jié)果顯示Dex可使IL-10分泌細胞輕度 增加， 但與對照相比無明顯差異， 說明Dex對IL-10分泌細胞無明影響。 由此推測， Dex 通過抑制IFN-γ而使Th1和Th2細胞之間的平衡得到恢復(fù)， 從而抑制炎癥反應(yīng)， 促進髓鞘再 生， BBB修復(fù)達到治療目的。
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(1999-09-30 收稿), 百拇醫(yī)藥