腦缺血再灌流后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡的研究△
作者：張敬軍 陳 青
單位：山東省泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微循環(huán)研究所，泰安衛(wèi)校(271000)
關(guān)鍵詞：沙土鼠；腦缺血；再灌流；海馬；細(xì)胞凋亡
中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)/990113 摘要 目的：觀察腦缺血再灌流后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。方法：鉗夾沙土鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈制造腦缺血模型，應(yīng)用Tunel法染色。結(jié)果：短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)生凋亡，CA2、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層、水平層、放射層、分子層及齒狀回部位未見細(xì)胞凋亡。結(jié)論：短暫性腦缺血可導(dǎo)致CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞凋亡是維持神經(jīng)系統(tǒng)正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要機(jī)制，近年研究表明，凋亡在某些疾病發(fā)生中起重要的作用。有研究提出，腦缺血可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的時(shí)間、部位、程度及機(jī)制還待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)用短暫性前腦缺血再灌注沙土鼠模型，用Tunel法染色，觀察腦缺血后不同時(shí)間再灌流細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，并對(duì)細(xì)胞凋亡與遲發(fā)性神經(jīng)元壞死的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。
, 百拇醫(yī)藥
材料和方法
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性沙土鼠體重70～80 g(約12周齡)32只，隨機(jī)分為4組，5 min前腦缺血再灌流2d、3d、4d及假手術(shù)對(duì)照組，各8只。
2.試劑與儀器 Apoptag試劑盒(美國(guó)ONCOR公司)。溫差電偶儀TME300(日本unique公司)。
3.腦缺血的制作及海馬腦片的制備 1.5%三氟溴氯乙烷吸入麻醉沙土鼠，選擇一側(cè)腦區(qū)，在前囟前及前囟一側(cè)各2 mm的交叉點(diǎn)，用溫差電偶探針垂直進(jìn)針2 mm，監(jiān)測(cè)腦溫并維持在(37 ±0.2)℃。暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，停止麻醉藥至動(dòng)物清醒，用無(wú)損傷的血管夾立即夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，5 min后撤夾恢復(fù)血流分別存活2d、3d、及4d，假手術(shù)對(duì)照組8只除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其他步驟同實(shí)驗(yàn)組。模型成功標(biāo)準(zhǔn)是：阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流后，動(dòng)物立即出現(xiàn)呼吸加快，肢體痙攣，在10s～1min內(nèi)昏迷，血流復(fù)通后，動(dòng)物分別在5～10 min蘇醒，不合上述標(biāo)準(zhǔn)者棄去不用。動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下，經(jīng)心依次灌注下列溶液：①PBS 50 ml。②4%的多聚甲醛300 ml。取出大腦，脫水透明，石蠟包埋。每只動(dòng)物取出前囟后1.0～1.3 mm間的連續(xù)6張冠狀背側(cè)海馬切片，片厚5 μm。
, 百拇醫(yī)藥
4.Tunel染色[1] ①二甲苯?jīng)_洗2次，每次5 min。②100%乙醇洗2次，每次5 min；95%乙醇洗3 min；70%乙醇洗3 min。③室溫下PBS沖洗3次，每次5 min。④蛋白酶K(20 μg/ml)消化，室溫孵育20 min。⑤同③。⑥2% H2O2孵育5 min。⑦同③。⑧平衡液(S7100-1)室溫孵育20 min；反應(yīng)液(S7100-2∶S7100-3為1∶2)37℃孵育1 h；停止液(S7100-4：蒸溜水為1∶34)室溫孵育20 min。⑨同③。10用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗Digoxigene抗體室溫孵化30 min。11同③。120.05%DAB顯色、脫水、透明、封片、鏡檢�？瞻讓�(duì)照不加TDT酶(S7100-3)，余同上。
結(jié)果
實(shí)驗(yàn)組均可觀察到凋亡細(xì)胞——DNA片段末端標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞皺縮，核染色陽(yáng)性，核固縮，可見核碎片，單個(gè)圓形凋亡小體。腦缺血再灌流2 d，CA1區(qū)有少量錐體細(xì)胞凋亡；再灌流3d，CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)高峰；再灌流4 d，CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡開始減少。凋亡細(xì)胞都是CA1區(qū)錐體細(xì)胞，短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)量變化不一，其定量分析結(jié)果見表1。CA2、CA3區(qū)及齒狀回各時(shí)間點(diǎn)均未見細(xì)胞凋亡。假手術(shù)對(duì)照組未見細(xì)胞凋亡。空白對(duì)照結(jié)果為陰性。
, 百拇醫(yī)藥
表1 短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡(N/mm) 組 別
n
±s
對(duì)照組
8
0
缺血再灌流2d
8
13.8±1.7
缺血再灌流3d
8
, 百拇醫(yī)藥 145.6±2.9
缺血再灌流4d
8
38.4±2.1
注：與對(duì)照組相比，*P<0.01
討論
短暫性前腦缺血再灌流2 d就有細(xì)胞凋亡發(fā)生，再灌流3 d細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，再灌流4 d細(xì)胞凋亡開始下降。腦缺血誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明，其可能機(jī)制是：腦缺血時(shí)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸從突觸前膜釋放，作用于突觸后膜上的谷氨酸受體，突觸后膜去極化達(dá)一定程度降低了鎂離子對(duì)谷氨酸受體的阻斷，鈣離子通過(guò)離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，細(xì)胞液鈣濃度升高被認(rèn)為是凋亡的始動(dòng)因素[2]：它激活與凋亡有關(guān)的各種酶，激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶使DNA降解[3]導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它激活誘生型NOS，引起NO合成增加，高濃度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脫氨基，造成突變和DNA鏈斷裂[4]；NO降低胞漿的pH[5]及抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成[6]；NO還增加p53表達(dá)[7]及減少細(xì)胞ATP合成[8]，NO的這些細(xì)胞毒性可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
, 百拇醫(yī)藥
不同神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的敏感性有很大差異，如果在相同缺血、缺氧條件下，腦組織中某一區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞易受損害，而鄰近區(qū)域或其他部位的神經(jīng)細(xì)胞較有耐受性，表現(xiàn)為選擇性易損，其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果CA1區(qū)錐體細(xì)胞最早且最易發(fā)生細(xì)胞凋亡，雖然人們對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，提出了許多假說(shuō)：包括興奮性氨基酸毒性、Ca2+超載、自由基損傷、信息傳遞、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成等，然而這些假說(shuō)均不能完全解釋CA1區(qū)錐體細(xì)胞為何選擇性易損。我們認(rèn)為其作用機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：(1)細(xì)胞的固有結(jié)構(gòu)、信息傳遞及胞內(nèi)代謝存在著明顯差異，是不同細(xì)胞對(duì)缺血耐受性不同的基礎(chǔ)原因之一。(2)從排列結(jié)構(gòu)上，CA1區(qū)錐體細(xì)胞可能更易受到有毒物質(zhì)的侵襲。(3)CA1區(qū)錐體細(xì)胞解毒、代償及修復(fù)、復(fù)制功能差。
CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡為何主要發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4 d，其機(jī)制可能是：細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中需要基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，細(xì)胞死亡前Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶將DNA切斷形成多核苷酸片段，電泳可見DNA的梯形條帶，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮和核轉(zhuǎn)移位，整個(gè)過(guò)程需2～4 d時(shí)間。文獻(xiàn)報(bào)道：腦缺血再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞最早且最易發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元壞死(Delayed neuronal death,DND)，且主要發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4d，機(jī)制未明。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果CA1區(qū)錐體細(xì)胞選擇性易發(fā)生細(xì)胞凋亡與選擇性易發(fā)生DND時(shí)間一致，如果其內(nèi)容一致，這些理論解釋了細(xì)胞凋亡或遲發(fā)性神經(jīng)元壞死為何發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4 d這一現(xiàn)象。
, 百拇醫(yī)藥
△山東省自然科學(xué)基金資助課題(Y98C19048)
參考文獻(xiàn)
[1].Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493.
[2].Takei,Endo Y.Ca2+ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons.Brain Res,1994,652:65.
[3].Evans VG.Multiple pathways to apoptosis.Cell Biol Int.1993,17:461
, 百拇醫(yī)藥
[4].Nguyen T,Brunson CL,Crespi BW, et al. DNA damage and mutation in human cells esposed to nitric oxide in vitro.Proc Natl Acadsci USA.1992,89:3030.
[5].Xie K,Dong Z,Fidler IJ.Activation of nitric oxide synthase gene for inhibition of cancer metastasis.J Leukoc Biol,1996,59:797.
[6].Lepoivre M,Chenais B,Yapo A, et al. Alterations of ribonucleotide reductase activity following induction of the nitrite-generating pathway in adenocarcinoma cells.J Biol Chem.1990,265:14143.
, 百拇醫(yī)藥
[7].Messmer UK,Lapetina EG,Brune B.Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages in antagonized by protein kinase C-and protein kinase A-activating compounds.Mol Pharmacol.1995,47:757.
[8].Albina TE,Cui S, Mateo RB, et al.Nitric oxide-mediated apoptosis inmurine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150:5080.
(1998年9月28日收稿), 百拇醫(yī)藥
單位：山東省泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院微循環(huán)研究所，泰安衛(wèi)校(271000)
關(guān)鍵詞：沙土鼠；腦缺血；再灌流；海馬；細(xì)胞凋亡
中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)/990113 摘要 目的：觀察腦缺血再灌流后海馬區(qū)細(xì)胞凋亡。方法：鉗夾沙土鼠的雙側(cè)頸總動(dòng)脈制造腦缺血模型，應(yīng)用Tunel法染色。結(jié)果：短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞發(fā)生凋亡，CA2、CA3區(qū)錐體細(xì)胞層、水平層、放射層、分子層及齒狀回部位未見細(xì)胞凋亡。結(jié)論：短暫性腦缺血可導(dǎo)致CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡。
細(xì)胞凋亡是維持神經(jīng)系統(tǒng)正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要機(jī)制，近年研究表明，凋亡在某些疾病發(fā)生中起重要的作用。有研究提出，腦缺血可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但導(dǎo)致細(xì)胞凋亡出現(xiàn)的時(shí)間、部位、程度及機(jī)制還待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)用短暫性前腦缺血再灌注沙土鼠模型，用Tunel法染色，觀察腦缺血后不同時(shí)間再灌流細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，并對(duì)細(xì)胞凋亡與遲發(fā)性神經(jīng)元壞死的關(guān)系進(jìn)行了初步探討。
, 百拇醫(yī)藥
材料和方法
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性沙土鼠體重70～80 g(約12周齡)32只，隨機(jī)分為4組，5 min前腦缺血再灌流2d、3d、4d及假手術(shù)對(duì)照組，各8只。
2.試劑與儀器 Apoptag試劑盒(美國(guó)ONCOR公司)。溫差電偶儀TME300(日本unique公司)。
3.腦缺血的制作及海馬腦片的制備 1.5%三氟溴氯乙烷吸入麻醉沙土鼠，選擇一側(cè)腦區(qū)，在前囟前及前囟一側(cè)各2 mm的交叉點(diǎn)，用溫差電偶探針垂直進(jìn)針2 mm，監(jiān)測(cè)腦溫并維持在(37 ±0.2)℃。暴露兩側(cè)頸總動(dòng)脈，停止麻醉藥至動(dòng)物清醒，用無(wú)損傷的血管夾立即夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，5 min后撤夾恢復(fù)血流分別存活2d、3d、及4d，假手術(shù)對(duì)照組8只除不夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈外，其他步驟同實(shí)驗(yàn)組。模型成功標(biāo)準(zhǔn)是：阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流后，動(dòng)物立即出現(xiàn)呼吸加快，肢體痙攣，在10s～1min內(nèi)昏迷，血流復(fù)通后，動(dòng)物分別在5～10 min蘇醒，不合上述標(biāo)準(zhǔn)者棄去不用。動(dòng)物在戊巴比妥鈉麻醉下，經(jīng)心依次灌注下列溶液：①PBS 50 ml。②4%的多聚甲醛300 ml。取出大腦，脫水透明，石蠟包埋。每只動(dòng)物取出前囟后1.0～1.3 mm間的連續(xù)6張冠狀背側(cè)海馬切片，片厚5 μm。
, 百拇醫(yī)藥
4.Tunel染色[1] ①二甲苯?jīng)_洗2次，每次5 min。②100%乙醇洗2次，每次5 min；95%乙醇洗3 min；70%乙醇洗3 min。③室溫下PBS沖洗3次，每次5 min。④蛋白酶K(20 μg/ml)消化，室溫孵育20 min。⑤同③。⑥2% H2O2孵育5 min。⑦同③。⑧平衡液(S7100-1)室溫孵育20 min；反應(yīng)液(S7100-2∶S7100-3為1∶2)37℃孵育1 h；停止液(S7100-4：蒸溜水為1∶34)室溫孵育20 min。⑨同③。10用過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗Digoxigene抗體室溫孵化30 min。11同③。120.05%DAB顯色、脫水、透明、封片、鏡檢�？瞻讓�(duì)照不加TDT酶(S7100-3)，余同上。
結(jié)果
實(shí)驗(yàn)組均可觀察到凋亡細(xì)胞——DNA片段末端標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞：細(xì)胞皺縮，核染色陽(yáng)性，核固縮，可見核碎片，單個(gè)圓形凋亡小體。腦缺血再灌流2 d，CA1區(qū)有少量錐體細(xì)胞凋亡；再灌流3d，CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)量達(dá)高峰；再灌流4 d，CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡開始減少。凋亡細(xì)胞都是CA1區(qū)錐體細(xì)胞，短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡數(shù)量變化不一，其定量分析結(jié)果見表1。CA2、CA3區(qū)及齒狀回各時(shí)間點(diǎn)均未見細(xì)胞凋亡。假手術(shù)對(duì)照組未見細(xì)胞凋亡。空白對(duì)照結(jié)果為陰性。
, 百拇醫(yī)藥
表1 短暫性前腦缺血不同時(shí)間再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡(N/mm) 組 別
n
±s對(duì)照組
8
0
缺血再灌流2d
8
13.8±1.7
缺血再灌流3d
8
, 百拇醫(yī)藥 145.6±2.9
缺血再灌流4d
8
38.4±2.1
注：與對(duì)照組相比，*P<0.01
討論
短暫性前腦缺血再灌流2 d就有細(xì)胞凋亡發(fā)生，再灌流3 d細(xì)胞凋亡達(dá)高峰，再灌流4 d細(xì)胞凋亡開始下降。腦缺血誘發(fā)細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚未完全闡明，其可能機(jī)制是：腦缺血時(shí)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸從突觸前膜釋放，作用于突觸后膜上的谷氨酸受體，突觸后膜去極化達(dá)一定程度降低了鎂離子對(duì)谷氨酸受體的阻斷，鈣離子通過(guò)離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，細(xì)胞液鈣濃度升高被認(rèn)為是凋亡的始動(dòng)因素[2]：它激活與凋亡有關(guān)的各種酶，激活鈣依賴性核酸內(nèi)切酶使DNA降解[3]導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。它激活誘生型NOS，引起NO合成增加，高濃度的NO使DNA中嘌呤和嘧啶脫氨基，造成突變和DNA鏈斷裂[4]；NO降低胞漿的pH[5]及抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成[6]；NO還增加p53表達(dá)[7]及減少細(xì)胞ATP合成[8]，NO的這些細(xì)胞毒性可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
, 百拇醫(yī)藥
不同神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的敏感性有很大差異，如果在相同缺血、缺氧條件下，腦組織中某一區(qū)域的神經(jīng)細(xì)胞易受損害，而鄰近區(qū)域或其他部位的神經(jīng)細(xì)胞較有耐受性，表現(xiàn)為選擇性易損，其機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果CA1區(qū)錐體細(xì)胞最早且最易發(fā)生細(xì)胞凋亡，雖然人們對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行了深入的研究，提出了許多假說(shuō)：包括興奮性氨基酸毒性、Ca2+超載、自由基損傷、信息傳遞、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成等，然而這些假說(shuō)均不能完全解釋CA1區(qū)錐體細(xì)胞為何選擇性易損。我們認(rèn)為其作用機(jī)制可能與下列因素有關(guān)：(1)細(xì)胞的固有結(jié)構(gòu)、信息傳遞及胞內(nèi)代謝存在著明顯差異，是不同細(xì)胞對(duì)缺血耐受性不同的基礎(chǔ)原因之一。(2)從排列結(jié)構(gòu)上，CA1區(qū)錐體細(xì)胞可能更易受到有毒物質(zhì)的侵襲。(3)CA1區(qū)錐體細(xì)胞解毒、代償及修復(fù)、復(fù)制功能差。
CA1區(qū)錐體細(xì)胞凋亡為何主要發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4 d，其機(jī)制可能是：細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中需要基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的合成，細(xì)胞死亡前Ca2+依賴性核酸內(nèi)切酶將DNA切斷形成多核苷酸片段，電泳可見DNA的梯形條帶，形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)濃縮和核轉(zhuǎn)移位，整個(gè)過(guò)程需2～4 d時(shí)間。文獻(xiàn)報(bào)道：腦缺血再灌流后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞最早且最易發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元壞死(Delayed neuronal death,DND)，且主要發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4d，機(jī)制未明。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果CA1區(qū)錐體細(xì)胞選擇性易發(fā)生細(xì)胞凋亡與選擇性易發(fā)生DND時(shí)間一致，如果其內(nèi)容一致，這些理論解釋了細(xì)胞凋亡或遲發(fā)性神經(jīng)元壞死為何發(fā)生于腦缺血再灌流后2～4 d這一現(xiàn)象。
, 百拇醫(yī)藥
△山東省自然科學(xué)基金資助課題(Y98C19048)
參考文獻(xiàn)
[1].Gavrieli Y,Sherman Y,Ben-sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.J Cell Biol,1992,119:493.
[2].Takei,Endo Y.Ca2+ionophore-induced apoptosis on cultured embryonic rat cortical neurons.Brain Res,1994,652:65.
[3].Evans VG.Multiple pathways to apoptosis.Cell Biol Int.1993,17:461
, 百拇醫(yī)藥
[4].Nguyen T,Brunson CL,Crespi BW, et al. DNA damage and mutation in human cells esposed to nitric oxide in vitro.Proc Natl Acadsci USA.1992,89:3030.
[5].Xie K,Dong Z,Fidler IJ.Activation of nitric oxide synthase gene for inhibition of cancer metastasis.J Leukoc Biol,1996,59:797.
[6].Lepoivre M,Chenais B,Yapo A, et al. Alterations of ribonucleotide reductase activity following induction of the nitrite-generating pathway in adenocarcinoma cells.J Biol Chem.1990,265:14143.
, 百拇醫(yī)藥
[7].Messmer UK,Lapetina EG,Brune B.Nitric oxide-induced apoptosis in RAW 264.7 macrophages in antagonized by protein kinase C-and protein kinase A-activating compounds.Mol Pharmacol.1995,47:757.
[8].Albina TE,Cui S, Mateo RB, et al.Nitric oxide-mediated apoptosis inmurine peritoneal macrophages.J Immunol,1993,150:5080.
(1998年9月28日收稿), 百拇醫(yī)藥