重組腺病毒介導HSV-TK基因對膠質瘤細胞的生長抑制
作者:史國利 房 欣 王金環(huán) 馮宇新 羅 勇 陳德風
單位:南開大學分子生物學研究所分子遺傳室(300071)
關鍵詞:重組腺病毒;HSV-TK基因;更昔洛韋(GCV);膠質母細胞瘤細胞系TJ905
中國臨床神經(jīng)科學/990103摘要 本文構建了帶有HSV-TK基因的腺病毒包裝質粒pACCMVTK,并獲得重組腺病毒AdCMVTK,用其感染膠質母細胞瘤細胞系TJ905,研究了HSV-TK/GCV系統(tǒng)對該細胞系的生長影響。結果發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對膠質母細胞瘤細胞系TJ905生長有明顯的抑制作用,以100 MOI(重復感染率)的病毒劑量感染細胞,GCV半數(shù)抑制濃度IC50僅為5 μmol,同時發(fā)現(xiàn)HSV-TK/GCV系統(tǒng)對TJ905細胞系有明顯的旁觀效應。表明該系統(tǒng)有治療膠質瘤的應用前景。
The Growth Inhibition of Glioma Cell
, 百拇醫(yī)藥
by Adenovirus-mediated HSV-TK Gene
Shi Guoli,Fang Xin,Wang Jinhuman,Feng Yuxing,Luo Yong,Chen Defeng
Insititute for Molecular Biology,Nankai University,Tianjin 300071
The plasmid pACCMVTK that expresses simple virus thymidine kinase (HSV-TK) gene was constructed,and recombinant adnovirus AdCMVTK was gained. Glioblastoma cells TJ905 were infected by AdCMVTK.The effect of HSV-TK/GCV system to growth of glioma cell was observed.The results showed HSV-TK/GCV can inhibit the growth of TJ905 cells efficiently,the IC50 was 5 μM when 100 MOI(multipicity of infection)recombinant adenovirus AdCMVTK infected TJ905 cells.Otherwise,a strong “bystander effect” of HSV-TK/GCV system was noted in tumor cell lines.The study indicated that AdCMVTK/GCV system may be used in treatment of glioma in the future.
, 百拇醫(yī)藥
Key Words Recombinant Adenovirus HSV-TK gene GCV Glioblastoma cell TJ905
人腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。目前的常規(guī)治療預后不良。近年來發(fā)展起來的基因治療給膠質瘤的治療提供了可能。國內(nèi)已有少數(shù)單位構建并在臨床應用了攜帶HSV-TK基因的逆轉錄病毒載體,該載體的優(yōu)點是能將病毒基因組永久地插入受其轉染的細胞染色體中,但同時也有可能引起插入突變,且逆轉錄病毒滴度低,感染宿主的范圍小。為尋求更安全有效的方法,本文構建了攜帶自殺基因的腺病毒載體,探討了其抑瘤作用,為臨床應用提供參考。
材料和方法
TJ905神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞系為天津醫(yī)科大學神經(jīng)病研究所神經(jīng)腫瘤室浦佩玉教授惠贈,293細胞為美國阿拉巴馬大學唐代駒博士惠贈。質粒pACCMVplpA,pBluescriptⅡ-TK及pJM17為美國阿拉巴馬大學唐代駒博士惠贈。
, http://www.www.srpcoatings.com
pACCMVTK質粒的構建參照文獻[1,2]及《分子克隆》[3],將pBluescriptⅡ-TK中HSV-TK插入到pACCMVplpA質粒的多克隆位點而成。細胞用含10%小牛血清的高糖DMEM(BRL)培養(yǎng)基培養(yǎng)。采取磷酸鈣沉淀法將pACCMVTK與pJM17共轉染293細胞,獲得重組腺病毒。轉染后8~10 d出現(xiàn)病毒空斑,篩選病毒克隆在293細胞中擴增培養(yǎng),提取病毒DNA。采用PCR方法鑒定重組病毒中HSV-TK基因,HSV1型TK基因的特異引物序列如下:5′端引物序列為5′CACAACACCGCCTCGACCAG3′,3′端引物序列為5′GCCAGGTCAAGCCGCTCGCC-3′。兩引物之間的堿基對為382 bp,PCR的反應體系為30 μl,反應條件為95℃ 40 s,72 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,30個循環(huán),產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。
TJ905細胞按1×104細胞/孔接種于24孔板,每個數(shù)據(jù)重復3個孔。當細胞生長到融合度達80%時,實驗組以100 MOI(重復感染率,multiplicity of infection)的病毒劑量感染細胞12 h,吸出病毒液,換入新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的GCV繼續(xù)培養(yǎng)5 d,細胞計數(shù);未加藥組細胞處理同試驗組,換液后不加GCV;GCV對照組細胞不用病毒感染,換液24 h后加入不同濃度的GCV;另外以不經(jīng)病毒和GCV處理的一組細胞為空白對照組。將各組的細胞數(shù)與空白對照組細胞數(shù)相比,得出細胞存活率。將感染病毒和未感染病毒的細胞按1∶0、1∶1、1∶4、1∶9、1∶19及0∶1比例接種于24孔板,混合培養(yǎng)24 h,每孔加入終濃度為500 μmol/L GCV,隔日換液培養(yǎng)5 d,細胞計數(shù),測定旁觀效應。
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結果
1、pACCMVTK質粒構建
XbaI,Hind Ⅲ雙酶切pBluescriptⅡTK,低熔點瓊脂糖電泳回收1.8 kb HSVTK基因片段,插入pACCMVplpA質粒的Xbal,HindⅢ多克隆位點,構建pACCMVTK(圖1)。質粒酶切鑒定圖譜見圖2所示。
圖1 pACCMVTK的構建路線
圖2 pACCMVTK酶切鑒定
2.重組腺病毒的獲得與鑒定
pJM17與pACCMVTK用磷酸鈣共沉淀法轉染293細胞,pJM17是一被替換插入4.3 kb外源片段環(huán)狀腺病毒基因組DNA,它提供除腺病毒E1區(qū)的主要腺病毒基因,利用同源重組可獲得表達TK基因的重組腺病毒。提取病毒DNA,PCR擴增得到380 bp左右的片段,說明得到AdCMVTK(圖3)。293細胞空斑法測得AdCMVTK,滴度為1.1×108pfu/ml(plaque forming unit,空斑形成單位)左右。
, 百拇醫(yī)藥
1.PACCMVTK DNA為模板的擴增結果
2.AdCMVTK DNA為模板的擴增結果
3.λDNA/Hind Ⅲ
圖3 AdCMVTK的PCR鑒定
3.GCV對感染AdCMVTK的TJ905細胞生長的影響
實驗表明,100MOI病毒粒子對TJ905細胞生長無明顯影響。用100MOI AdCMVTK感染細胞,加入不同濃度GCV培養(yǎng)6d,從圖4可看出其對細胞生長抑制明顯,半數(shù)抑制濃度約為5 μmol。
圖4 GCV對感染與未感染AdCMVTK的TJ905細胞生長的影響
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4.旁觀效應
用同樣濃度GCV藥物處理按不同比例混合培養(yǎng)的感染和非感染細胞,細胞存活率的測定結果表明,按1∶19比例混合培養(yǎng)5 d時,細胞只存活10%,而按1∶1,1∶9比例接種的細胞則大部分死亡,顯示了很強的旁觀效應,見圖5。
圖5 感染AdCMVTK的TJ905細胞的旁觀效應
討論
HSVTK基因是單純皰疹病毒的胸苷激酶基因,該酶底物特異性不強,可催化核苷類似物無環(huán)鳥苷(GCV)磷酸化,使之可以在DNA復制過程摻入DNA鏈,阻礙DNA復制,抑制細胞分裂,導致細胞在GCV存在時發(fā)生凋亡。與之相鄰不表達TK基因的細胞也產(chǎn)生凋亡,稱為“旁觀效應”[4]。重組腺病毒載體比逆轉錄病毒載體更具安全性,能感染不同組織,滴度高,且能感染分裂緩慢的細胞[1,5]。本文構建了AdCMVTK,并用100個重組腺病毒/細胞的低劑量感染TJ905細胞系,24 h后應用 GCV治療,細胞的生長受到明顯的抑制。盡管有人[1]在其他腫瘤細胞系實驗過高劑量的病毒如500~2 000個重組腺病毒/細胞具有非常滿意的效果,但考慮到體內(nèi)只能采取局部注射,病毒會從注射部位向周圍擴散而形成濃度梯度,邊緣處的濃度是觀察重組腺病毒賦予腫瘤細胞對GCV藥物敏感性的最佳點,因而使用最低有效劑量,得到的數(shù)據(jù)對臨床治療來講最具參考價值。GCV對于未感染重組腺病毒的瘤細胞,即使?jié)舛冗_到100 μmol/L仍無明顯影響,但對于感染過重組腺病毒的瘤細胞,IC50僅為5 μmol,隨著劑量的增加,效果更明顯。
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從實驗結果還可看出,GCV藥物作用后,感染AdCMV-TK重組腺病毒的TJ905細胞產(chǎn)生的旁觀效應非常明顯。這種旁觀效應增強了AdCMV-TK/GCV系統(tǒng)治療膠質瘤的可行性,提高了此系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的效率。
AdCMV-TK/GCV系統(tǒng)治療腫瘤的不足在于缺乏靶向性。另外,腺病毒衣殼五鄰體蛋白造成的細胞毒副作用在動物體內(nèi)也會產(chǎn)生嚴重后果,有報道1.5×109 pfu病毒粒子與GCV共同作用引起狒狒死亡[6],因此必須嚴格控制實驗中病毒濃度。
參考文獻
[1].Smythe WR, et al. Use of recombinant adenovirus of transfering the herpes simplex virus thymidine kinese (HSVtk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitroing drug sensitization system.Cancer Res.1994, 54:2055.
, http://www.www.srpcoatings.com
[2].Englehardt JF, et al. Direct gene transfer of human CFIR into human bronchial epithelia of xenografts with E1-deleted adenoviruses.Nature Genet,1993,4:27.
[3].Sambrook J, et al. 分子克隆.第二版.北京:科學出版社,1992:16.
[4].Hamel W, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res.1996,56:2607.
[5].Ross C, et al. Gene therapy in the United States:a five year status report.Human Gene Therapy,1996,7:1781.
[6].Goodman JC, et al. Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic,radiologic and molecular studies.Human Gene Therapy.1996,7:1241.
(1998年9月15日收稿 1998年12月25日修回), 百拇醫(yī)藥
單位:南開大學分子生物學研究所分子遺傳室(300071)
關鍵詞:重組腺病毒;HSV-TK基因;更昔洛韋(GCV);膠質母細胞瘤細胞系TJ905
中國臨床神經(jīng)科學/990103摘要 本文構建了帶有HSV-TK基因的腺病毒包裝質粒pACCMVTK,并獲得重組腺病毒AdCMVTK,用其感染膠質母細胞瘤細胞系TJ905,研究了HSV-TK/GCV系統(tǒng)對該細胞系的生長影響。結果發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對膠質母細胞瘤細胞系TJ905生長有明顯的抑制作用,以100 MOI(重復感染率)的病毒劑量感染細胞,GCV半數(shù)抑制濃度IC50僅為5 μmol,同時發(fā)現(xiàn)HSV-TK/GCV系統(tǒng)對TJ905細胞系有明顯的旁觀效應。表明該系統(tǒng)有治療膠質瘤的應用前景。
The Growth Inhibition of Glioma Cell
, 百拇醫(yī)藥
by Adenovirus-mediated HSV-TK Gene
Shi Guoli,Fang Xin,Wang Jinhuman,Feng Yuxing,Luo Yong,Chen Defeng
Insititute for Molecular Biology,Nankai University,Tianjin 300071
The plasmid pACCMVTK that expresses simple virus thymidine kinase (HSV-TK) gene was constructed,and recombinant adnovirus AdCMVTK was gained. Glioblastoma cells TJ905 were infected by AdCMVTK.The effect of HSV-TK/GCV system to growth of glioma cell was observed.The results showed HSV-TK/GCV can inhibit the growth of TJ905 cells efficiently,the IC50 was 5 μM when 100 MOI(multipicity of infection)recombinant adenovirus AdCMVTK infected TJ905 cells.Otherwise,a strong “bystander effect” of HSV-TK/GCV system was noted in tumor cell lines.The study indicated that AdCMVTK/GCV system may be used in treatment of glioma in the future.
, 百拇醫(yī)藥
Key Words Recombinant Adenovirus HSV-TK gene GCV Glioblastoma cell TJ905
人腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。目前的常規(guī)治療預后不良。近年來發(fā)展起來的基因治療給膠質瘤的治療提供了可能。國內(nèi)已有少數(shù)單位構建并在臨床應用了攜帶HSV-TK基因的逆轉錄病毒載體,該載體的優(yōu)點是能將病毒基因組永久地插入受其轉染的細胞染色體中,但同時也有可能引起插入突變,且逆轉錄病毒滴度低,感染宿主的范圍小。為尋求更安全有效的方法,本文構建了攜帶自殺基因的腺病毒載體,探討了其抑瘤作用,為臨床應用提供參考。
材料和方法
TJ905神經(jīng)膠質母細胞瘤細胞系為天津醫(yī)科大學神經(jīng)病研究所神經(jīng)腫瘤室浦佩玉教授惠贈,293細胞為美國阿拉巴馬大學唐代駒博士惠贈。質粒pACCMVplpA,pBluescriptⅡ-TK及pJM17為美國阿拉巴馬大學唐代駒博士惠贈。
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pACCMVTK質粒的構建參照文獻[1,2]及《分子克隆》[3],將pBluescriptⅡ-TK中HSV-TK插入到pACCMVplpA質粒的多克隆位點而成。細胞用含10%小牛血清的高糖DMEM(BRL)培養(yǎng)基培養(yǎng)。采取磷酸鈣沉淀法將pACCMVTK與pJM17共轉染293細胞,獲得重組腺病毒。轉染后8~10 d出現(xiàn)病毒空斑,篩選病毒克隆在293細胞中擴增培養(yǎng),提取病毒DNA。采用PCR方法鑒定重組病毒中HSV-TK基因,HSV1型TK基因的特異引物序列如下:5′端引物序列為5′CACAACACCGCCTCGACCAG3′,3′端引物序列為5′GCCAGGTCAAGCCGCTCGCC-3′。兩引物之間的堿基對為382 bp,PCR的反應體系為30 μl,反應條件為95℃ 40 s,72 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,30個循環(huán),產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳。
TJ905細胞按1×104細胞/孔接種于24孔板,每個數(shù)據(jù)重復3個孔。當細胞生長到融合度達80%時,實驗組以100 MOI(重復感染率,multiplicity of infection)的病毒劑量感染細胞12 h,吸出病毒液,換入新鮮培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的GCV繼續(xù)培養(yǎng)5 d,細胞計數(shù);未加藥組細胞處理同試驗組,換液后不加GCV;GCV對照組細胞不用病毒感染,換液24 h后加入不同濃度的GCV;另外以不經(jīng)病毒和GCV處理的一組細胞為空白對照組。將各組的細胞數(shù)與空白對照組細胞數(shù)相比,得出細胞存活率。將感染病毒和未感染病毒的細胞按1∶0、1∶1、1∶4、1∶9、1∶19及0∶1比例接種于24孔板,混合培養(yǎng)24 h,每孔加入終濃度為500 μmol/L GCV,隔日換液培養(yǎng)5 d,細胞計數(shù),測定旁觀效應。
, http://www.www.srpcoatings.com
結果
1、pACCMVTK質粒構建
XbaI,Hind Ⅲ雙酶切pBluescriptⅡTK,低熔點瓊脂糖電泳回收1.8 kb HSVTK基因片段,插入pACCMVplpA質粒的Xbal,HindⅢ多克隆位點,構建pACCMVTK(圖1)。質粒酶切鑒定圖譜見圖2所示。
圖1 pACCMVTK的構建路線
圖2 pACCMVTK酶切鑒定
2.重組腺病毒的獲得與鑒定
pJM17與pACCMVTK用磷酸鈣共沉淀法轉染293細胞,pJM17是一被替換插入4.3 kb外源片段環(huán)狀腺病毒基因組DNA,它提供除腺病毒E1區(qū)的主要腺病毒基因,利用同源重組可獲得表達TK基因的重組腺病毒。提取病毒DNA,PCR擴增得到380 bp左右的片段,說明得到AdCMVTK(圖3)。293細胞空斑法測得AdCMVTK,滴度為1.1×108pfu/ml(plaque forming unit,空斑形成單位)左右。
, 百拇醫(yī)藥
1.PACCMVTK DNA為模板的擴增結果
2.AdCMVTK DNA為模板的擴增結果
3.λDNA/Hind Ⅲ
圖3 AdCMVTK的PCR鑒定
3.GCV對感染AdCMVTK的TJ905細胞生長的影響
實驗表明,100MOI病毒粒子對TJ905細胞生長無明顯影響。用100MOI AdCMVTK感染細胞,加入不同濃度GCV培養(yǎng)6d,從圖4可看出其對細胞生長抑制明顯,半數(shù)抑制濃度約為5 μmol。
圖4 GCV對感染與未感染AdCMVTK的TJ905細胞生長的影響
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4.旁觀效應
用同樣濃度GCV藥物處理按不同比例混合培養(yǎng)的感染和非感染細胞,細胞存活率的測定結果表明,按1∶19比例混合培養(yǎng)5 d時,細胞只存活10%,而按1∶1,1∶9比例接種的細胞則大部分死亡,顯示了很強的旁觀效應,見圖5。
圖5 感染AdCMVTK的TJ905細胞的旁觀效應
討論
HSVTK基因是單純皰疹病毒的胸苷激酶基因,該酶底物特異性不強,可催化核苷類似物無環(huán)鳥苷(GCV)磷酸化,使之可以在DNA復制過程摻入DNA鏈,阻礙DNA復制,抑制細胞分裂,導致細胞在GCV存在時發(fā)生凋亡。與之相鄰不表達TK基因的細胞也產(chǎn)生凋亡,稱為“旁觀效應”[4]。重組腺病毒載體比逆轉錄病毒載體更具安全性,能感染不同組織,滴度高,且能感染分裂緩慢的細胞[1,5]。本文構建了AdCMVTK,并用100個重組腺病毒/細胞的低劑量感染TJ905細胞系,24 h后應用 GCV治療,細胞的生長受到明顯的抑制。盡管有人[1]在其他腫瘤細胞系實驗過高劑量的病毒如500~2 000個重組腺病毒/細胞具有非常滿意的效果,但考慮到體內(nèi)只能采取局部注射,病毒會從注射部位向周圍擴散而形成濃度梯度,邊緣處的濃度是觀察重組腺病毒賦予腫瘤細胞對GCV藥物敏感性的最佳點,因而使用最低有效劑量,得到的數(shù)據(jù)對臨床治療來講最具參考價值。GCV對于未感染重組腺病毒的瘤細胞,即使?jié)舛冗_到100 μmol/L仍無明顯影響,但對于感染過重組腺病毒的瘤細胞,IC50僅為5 μmol,隨著劑量的增加,效果更明顯。
, http://www.www.srpcoatings.com
從實驗結果還可看出,GCV藥物作用后,感染AdCMV-TK重組腺病毒的TJ905細胞產(chǎn)生的旁觀效應非常明顯。這種旁觀效應增強了AdCMV-TK/GCV系統(tǒng)治療膠質瘤的可行性,提高了此系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞的效率。
AdCMV-TK/GCV系統(tǒng)治療腫瘤的不足在于缺乏靶向性。另外,腺病毒衣殼五鄰體蛋白造成的細胞毒副作用在動物體內(nèi)也會產(chǎn)生嚴重后果,有報道1.5×109 pfu病毒粒子與GCV共同作用引起狒狒死亡[6],因此必須嚴格控制實驗中病毒濃度。
參考文獻
[1].Smythe WR, et al. Use of recombinant adenovirus of transfering the herpes simplex virus thymidine kinese (HSVtk) gene to thoracic neoplasms: an effective in vitroing drug sensitization system.Cancer Res.1994, 54:2055.
, http://www.www.srpcoatings.com
[2].Englehardt JF, et al. Direct gene transfer of human CFIR into human bronchial epithelia of xenografts with E1-deleted adenoviruses.Nature Genet,1993,4:27.
[3].Sambrook J, et al. 分子克隆.第二版.北京:科學出版社,1992:16.
[4].Hamel W, et al. Herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir-mediated apoptotic death of bystander cells.Cancer Res.1996,56:2607.
[5].Ross C, et al. Gene therapy in the United States:a five year status report.Human Gene Therapy,1996,7:1781.
[6].Goodman JC, et al. Adenoviral-mediated thymidine kinase gene transfer into the primate brain followed by systemic ganciclovir pathologic,radiologic and molecular studies.Human Gene Therapy.1996,7:1241.
(1998年9月15日收稿 1998年12月25日修回), 百拇醫(yī)藥