生長抑制DNA損傷基因45與p53對卵巢癌細胞凋亡作用的研究
作者：周志春 馮捷 錢和年 崔恒 傅天云 葉雪
單位：北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院婦科腫瘤研究中心，100034
關鍵詞：生長抑制DNA損傷基因45；p53；卵巢腫瘤；細胞凋亡
現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展990103 摘要 目的：研究生長抑制DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage，GADD)對卵巢癌細胞的作用及與p53蛋白表達的關系。方法：利用RT-PCR鑒定卵巢癌SKOV3和3AO細胞株GADD45的表達；采用RT-PCR和Western Blot鑒定SKOV3和3AO細胞株p53蛋白的表達。通過載體構建將目的基因GADD45重組于pcDNA-Ⅲ真核質粒內(nèi)。利用脂質體(DOTAP)法轉染SKOV3和3AO細胞株；G418抗性篩選，RT-PCR進行表達鑒定。采用流式細胞儀分析(FCM)以及DNA梯度法對細胞凋亡現(xiàn)象進行檢測。結果：卵巢癌SKOV3和3AO細胞株GADD45表達陰性。SKOV3細胞株p53蛋白表達陽性；3AO細胞株p53蛋白表達陰性。轉染GADD45基因的SKOV3細胞株經(jīng)化學藥物足葉已甙(VP16)和紫外線誘導后，可以使該細胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，而對轉染GADD45基因的3AO細胞株經(jīng)誘導后，未見細胞凋亡現(xiàn)象。結論：轉染GADD45基因，對p53蛋白表達陽性的細胞株SKOV3經(jīng)誘導后，可使細胞進入凋亡狀態(tài)。對p53蛋白表達陰性的細胞株3AO轉染GADD45基因后，經(jīng)誘導細胞無凋亡現(xiàn)象，證實GADD45作用途徑可能是通過野生型p53蛋白作用實現(xiàn)的，其細胞凋亡作用依賴于p53蛋白的表達。
, 百拇醫(yī)藥
Study of the effects of GADD45 and p53 protein on apoptosis of ovarian carcinoma cell lines
Zhou Zhichun，F(xiàn)eng Jie，Qian Henian，et al.
Gynecologic Oncology Center，Peoples Hospial of Beijing Medical University，100034
Abstract Objective：To study the effects of growth arrest and DNA damage(GADD)gene 45 on ovarian cancer cell lines and the relationship between the effect and the expression of p53 protein.Methods：Expressions of GADD45 and p53 protein in ovarian cancer cell liines SKOV3 and 3AO were identified respectively using RT-PCR and Western Blot.A eukaryotic expressing vector encoding GADD45 named pcDNA-GADD45 was constructed and transfected into SKOV3 and 3AO cell lines with lipofectin(DOTAP)，then selected by anti-G418.The expression of GADD45 was identified using RT-PCR.Apoptosis was analyzed using FCM and DNA ladder.Results：The expression of GADD45 in ovarian cancer cell lines SKOV3 and 3AO was not detected.There was positive expression of p53 protein in SKOV3 whereas negative expression in 3AO.It was in the SKOV3 transferred GADD45 gene after induction by VP16 and UV-irradiation that the apoptosis was found，but no apoptosis in the 3AO transferred the same gene.Conclusions：The cell line，which has positive expression of p53 protein transferred GADD45 gene shows the apoptosis after induction by VP16 and UV-irradiation.The cell line，however，which has negative expression of p53 protein，couldn t show the apoptosis.The function of GADD45 gene may be dependent on the wild type p53 protein.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Growth arrest DNA damage45；P53；Ovarian neoplasms；Apoptosis
GADD基因組是在腫瘤基因治療研究中涌現(xiàn)出來的，它可在DNA損傷因素的誘導下，發(fā)揮使細胞生長抑制和細胞凋亡的作用。卵巢癌(ovarian carcinoma，OC)為婦科腫瘤患者重要的死亡原因。我們就GADD45對p53蛋白不同表達的OC細胞株的作用作了研究，報道如下。
1 材料與方法
1.1 細胞株 SKOV3為卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株，購自美國Memorial Sloan-Kettering Cancer Center；3AO為卵巢上皮癌細胞株引自上海中科院細胞庫。
1.2 質粒和菌株 質粒pSK-GADD45(含GADD45全序列1.4kbp)和菌株大腸桿菌DH5-α均系北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院中心實驗室王申五老師惠贈。
, http://www.www.srpcoatings.com
1.3 試劑 內(nèi)切酶、T4連接酶及G418均為Sigma產(chǎn)品，lipofectin(DOTAP)購自Boehringer Mannheim公司；小鼠抗人p53單抗系Santa Cruz公司產(chǎn)品，RNA及RT-PCR試劑盒購自同正公司。
1.4 Western Blot鑒定用于SKOV3和3AO細胞株中p53蛋白的表達。
1.5 真核重組質粒構建及鑒定 pSK-GADD45經(jīng)Not-a、Kpn-1雙切酶，低熔點瓊脂糖電泳回收目的基因GADD45，用T4連接酶將其連接到經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的質粒pcDNA-Ⅲ大片段上，構建成重組質粒pcDNA-GADD45，轉化大腸桿菌DH5-α，提取質粒進行酶切鑒定。
1.6 細胞轉染 采用lipofectin(DΟΤΑΡ)將pcDNA-GADD45重組質粒和pcDNA-Ⅲ原質粒分別轉染SKOV3和3AO細胞株后，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(前者為實驗組，后者為對照組，親本細胞為空白對照組)。
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1.7 轉染細胞的篩選 根據(jù)真核質粒有G418抗性，用G418進行篩選培養(yǎng)。從高濃度(600μg/ml)開始，當對照組細胞大部分死亡，G418的濃度降低一半(300μl/ml)時，維持篩選，待長出單克隆后，擴大培養(yǎng)。
1.8 G418篩選后的細胞鑒定 根據(jù)GADD45基因全序列，設計上、下游引物：S：5'-TGTCGTT
-CTCGCAGCAAA-3' SA：5'-TGGATAAGGTG-GGGGATG-3'。RT-PCR內(nèi)參引物為(β-actin)：S：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'SA：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。提取細胞RNA，按試劑盒說明進行RT-PCR，并利用RT-PCR鑒定SKOV3和3AO細胞株GADD45的表達。
1.9 親本細胞SKOV3和3AO誘導 在超凈臺內(nèi)，用紫外線燈消毒，距離待測細胞20cm，垂直照射8min，5%CO2、37℃培養(yǎng)6～8h。RT-PCR測定其GADD45表達。
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1.10 轉染細胞的誘導 用不同濃度的足葉己甙(VP16)誘導后，于5%CO2、37℃培養(yǎng)24h，測定細胞凋亡指標。
1.11 細胞凋亡測定 ①碘化丙錠(PI)熒光染色流式細胞儀(FCM)分析細胞凋亡；②DNA“l(fā)adder”的測定：收集約5×106待檢細胞，用細胞裂解液(1%NP40、20mmol EDTA pH8.0、50mmol Tris.Cl pH7.5)裂解，蛋白酶K消化，提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V，2～3h)后觀察結果。
2 結果
2.1 SKOV3和3AO細胞株，誘導后經(jīng)RT-PCR鑒定缺乏GADD45基因的表達。
2.2 Western Blot檢測SKOV3和3AO細胞株野生型p53蛋白表達結果 SKOV3表達陽性；3AO為陰性，見照片1。
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2.3 重組質粒pcDNA-GADD45經(jīng)Not-1和Kpn-1雙酶切鑒定 在1.4kbp處可見一條帶，重組成功，見照片2。
2.4 RT-PCR檢測轉染GADD45基因的SKOV3和3AO細胞株經(jīng)誘導后GADD45的表達，SKOV3-GADD45表達陽性；3AO-GADD45表達陰性，見照片3。
照片1 Western Blot測定SKOV3和3AO細胞株p35蛋白表達結果
1：SKOV3細胞株蛋白 2：3AO細胞株蛋白
照片2 pCDNA-GADD45酶切鑒定結果
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1：pCDNA-GADD45經(jīng)Kpn-Ⅰ和Not-Ⅰ雙酶切產(chǎn)物可見在1.4kb處有一條帶
2：PBR322/BSTN-Ⅰ marker
2.5 細胞凋亡測定 ①FCM分析結果：轉染GADD45基因的細胞，經(jīng)80μg/ml、160μg/ml的VP16誘導在培養(yǎng)24h后,SKOV3細胞株可出現(xiàn)G1期延長及細胞凋亡峰，3AO細胞株無明顯的G1期延長及細胞凋亡峰出現(xiàn)。對照組和空白對照組均無G1期延長和細胞凋亡峰出現(xiàn)；②DNA“l(fā)adder”測定 轉染GADD45基因的細胞經(jīng)VP16 80μg/ml誘導，培養(yǎng)24h后，SKOV3細胞株可出現(xiàn)DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)，見照片4。3AO細胞株則無DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)。對照組和空白對照組均未出現(xiàn)DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)。
照片3 經(jīng)UV誘導的SKOV3-GADD45，3AO-GADD45，RT-PCR鑒定結果
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1：3AO-GADD45 RT-PCR產(chǎn)物未見有條帶
2：SKOV3-GADD45 RT-PCR產(chǎn)物可見在1.4kbp處有一條帶
M：PBR322/BSTN-Ⅰ marker
照片4 VP16誘導SKOV3-GADD45細胞凋亡DNA“l(fā)adder” 1、2、3、4：不同濃度的VP16誘導培養(yǎng)24h 5、6：80μg/ml、160μg/ml的VP16培養(yǎng)24h
3 討論
GADD基因組是在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中涌出的新發(fā)現(xiàn)，可在DNA損傷因素的作用下，發(fā)揮使細胞生長受抑和凋亡的作用[1]。
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本實驗結果表明，經(jīng)RT-PCR鑒定無GADD45基因表達的OC細胞株SKOV3和3AO，和轉入pcDNA-Ⅲ空質粒的SKOV3和3AO細胞株，經(jīng)過VP16以及UV的誘導，均無G1期延長和細胞凋亡。而轉入GADD45基因的SKOV3細胞株，誘導后G1期延長，并且進入細胞凋亡的狀態(tài)。細胞凋亡與細胞增殖、分化一樣，是一個級聯(lián)式的基因表達結果。這一過程有許多癌基因和抑癌基因參與。GADD基因的表達可使細胞生長抑制在G1/G0期，或使腫瘤出現(xiàn)細胞凋亡[2]。在GADD基因表達缺失及在相關基因的作用下，細胞失控，使細胞增殖和抑制發(fā)生偏離，可能是組織發(fā)生腫瘤的原因之一。 Slichenmyer等[3]指出：GADD45是依賴于野生型p53作用的蛋白，它在腫瘤細胞凋亡中所起的級聯(lián)橋梁作用是依賴p53途徑實現(xiàn)的。在p53所致細胞凋亡和生長抑制的基因級聯(lián)中，直接受p53調(diào)控，是連接p53和下一級細胞凋亡相關的重要中間環(huán)節(jié)，由此提示：p53的表達產(chǎn)物是GADD45的調(diào)節(jié)蛋白。
, 百拇醫(yī)藥
本研究結果還表明，通過轉染GADD45基因的SKOV3和3AO并篩選為陽性的細胞株，經(jīng)FCM分析提示：SKOV3細胞株出現(xiàn)G1期延長和細胞凋亡狀態(tài)；而3AO細胞株無G1期延長和凋亡。經(jīng)過Western Blot鑒定；SKOV3細胞株有p53蛋白表達；3AO細胞株缺乏p53蛋白的表達。故本實驗證實GADD45對腫瘤細胞的作用是依賴于正常p53的功能。在DNA損傷的應答中，損傷因子是通過一個轉錄后機制誘導野生型p53表達，阻斷細胞周期，使損傷DNA得以修復[4]。這是因為p53蛋白產(chǎn)物可以延長細胞周期的進程，使細胞停滯于DNA復制啟動之前，或復制之時。當腫瘤細胞轉染GADD45基因，此基因的表達使DNA的損傷不可能恢復，而使細胞改道進入程序化死亡途徑[5]。
參考文獻
1.Hollander MC，Alamc I，et al.Analysis of the mammalian GADD45 gene and its response to DNA damage J BiolChem 1993；15：268(32)：2438
, http://www.www.srpcoatings.com
2.Fornace A，Alamo I， et al.DNA damage inducible transcripts in mammalinan cell.Proc Natl Acad Sci USA 1988;85：8800
3.Slichenmyer WJ，Nelsos WJ，et al. Loss of a p53 associated Gl checkpoint does not decrease all survival following DNA damege.Cancer Res 1993；53：4164
4.Miyashita T，Harigai M，et al.Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene.Cancer Res 1994；54；3131
5.Fornace A，Alamo I，et al.DNA damage-inducible transcripts in mammalinan cells.Proc Natl Acad Sci USA 1988；85：8800
(收稿日期 1998-06-20), 百拇醫(yī)藥
單位：北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院婦科腫瘤研究中心，100034
關鍵詞：生長抑制DNA損傷基因45；p53；卵巢腫瘤；細胞凋亡
現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展990103 摘要 目的：研究生長抑制DNA損傷基因(growth arrest and DNA damage，GADD)對卵巢癌細胞的作用及與p53蛋白表達的關系。方法：利用RT-PCR鑒定卵巢癌SKOV3和3AO細胞株GADD45的表達；采用RT-PCR和Western Blot鑒定SKOV3和3AO細胞株p53蛋白的表達。通過載體構建將目的基因GADD45重組于pcDNA-Ⅲ真核質粒內(nèi)。利用脂質體(DOTAP)法轉染SKOV3和3AO細胞株；G418抗性篩選，RT-PCR進行表達鑒定。采用流式細胞儀分析(FCM)以及DNA梯度法對細胞凋亡現(xiàn)象進行檢測。結果：卵巢癌SKOV3和3AO細胞株GADD45表達陰性。SKOV3細胞株p53蛋白表達陽性；3AO細胞株p53蛋白表達陰性。轉染GADD45基因的SKOV3細胞株經(jīng)化學藥物足葉已甙(VP16)和紫外線誘導后，可以使該細胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象，而對轉染GADD45基因的3AO細胞株經(jīng)誘導后，未見細胞凋亡現(xiàn)象。結論：轉染GADD45基因，對p53蛋白表達陽性的細胞株SKOV3經(jīng)誘導后，可使細胞進入凋亡狀態(tài)。對p53蛋白表達陰性的細胞株3AO轉染GADD45基因后，經(jīng)誘導細胞無凋亡現(xiàn)象，證實GADD45作用途徑可能是通過野生型p53蛋白作用實現(xiàn)的，其細胞凋亡作用依賴于p53蛋白的表達。
, 百拇醫(yī)藥
Study of the effects of GADD45 and p53 protein on apoptosis of ovarian carcinoma cell lines
Zhou Zhichun，F(xiàn)eng Jie，Qian Henian，et al.
Gynecologic Oncology Center，Peoples Hospial of Beijing Medical University，100034
Abstract Objective：To study the effects of growth arrest and DNA damage(GADD)gene 45 on ovarian cancer cell lines and the relationship between the effect and the expression of p53 protein.Methods：Expressions of GADD45 and p53 protein in ovarian cancer cell liines SKOV3 and 3AO were identified respectively using RT-PCR and Western Blot.A eukaryotic expressing vector encoding GADD45 named pcDNA-GADD45 was constructed and transfected into SKOV3 and 3AO cell lines with lipofectin(DOTAP)，then selected by anti-G418.The expression of GADD45 was identified using RT-PCR.Apoptosis was analyzed using FCM and DNA ladder.Results：The expression of GADD45 in ovarian cancer cell lines SKOV3 and 3AO was not detected.There was positive expression of p53 protein in SKOV3 whereas negative expression in 3AO.It was in the SKOV3 transferred GADD45 gene after induction by VP16 and UV-irradiation that the apoptosis was found，but no apoptosis in the 3AO transferred the same gene.Conclusions：The cell line，which has positive expression of p53 protein transferred GADD45 gene shows the apoptosis after induction by VP16 and UV-irradiation.The cell line，however，which has negative expression of p53 protein，couldn t show the apoptosis.The function of GADD45 gene may be dependent on the wild type p53 protein.
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Key words Growth arrest DNA damage45；P53；Ovarian neoplasms；Apoptosis
GADD基因組是在腫瘤基因治療研究中涌現(xiàn)出來的，它可在DNA損傷因素的誘導下，發(fā)揮使細胞生長抑制和細胞凋亡的作用。卵巢癌(ovarian carcinoma，OC)為婦科腫瘤患者重要的死亡原因。我們就GADD45對p53蛋白不同表達的OC細胞株的作用作了研究，報道如下。
1 材料與方法
1.1 細胞株 SKOV3為卵巢漿液性乳頭狀囊腺癌細胞株，購自美國Memorial Sloan-Kettering Cancer Center；3AO為卵巢上皮癌細胞株引自上海中科院細胞庫。
1.2 質粒和菌株 質粒pSK-GADD45(含GADD45全序列1.4kbp)和菌株大腸桿菌DH5-α均系北京醫(yī)科大學人民醫(yī)院中心實驗室王申五老師惠贈。
, http://www.www.srpcoatings.com
1.3 試劑 內(nèi)切酶、T4連接酶及G418均為Sigma產(chǎn)品，lipofectin(DOTAP)購自Boehringer Mannheim公司；小鼠抗人p53單抗系Santa Cruz公司產(chǎn)品，RNA及RT-PCR試劑盒購自同正公司。
1.4 Western Blot鑒定用于SKOV3和3AO細胞株中p53蛋白的表達。
1.5 真核重組質粒構建及鑒定 pSK-GADD45經(jīng)Not-a、Kpn-1雙切酶，低熔點瓊脂糖電泳回收目的基因GADD45，用T4連接酶將其連接到經(jīng)相同內(nèi)切酶酶切的質粒pcDNA-Ⅲ大片段上，構建成重組質粒pcDNA-GADD45，轉化大腸桿菌DH5-α，提取質粒進行酶切鑒定。
1.6 細胞轉染 采用lipofectin(DΟΤΑΡ)將pcDNA-GADD45重組質粒和pcDNA-Ⅲ原質粒分別轉染SKOV3和3AO細胞株后，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(前者為實驗組，后者為對照組，親本細胞為空白對照組)。
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1.7 轉染細胞的篩選 根據(jù)真核質粒有G418抗性，用G418進行篩選培養(yǎng)。從高濃度(600μg/ml)開始，當對照組細胞大部分死亡，G418的濃度降低一半(300μl/ml)時，維持篩選，待長出單克隆后，擴大培養(yǎng)。
1.8 G418篩選后的細胞鑒定 根據(jù)GADD45基因全序列，設計上、下游引物：S：5'-TGTCGTT
-CTCGCAGCAAA-3' SA：5'-TGGATAAGGTG-GGGGATG-3'。RT-PCR內(nèi)參引物為(β-actin)：S：5'-ATCATGTTTGAGACCTTCAACA-3'SA：5'-CATCTCTTGCTCGAAGTCCA-3'。提取細胞RNA，按試劑盒說明進行RT-PCR，并利用RT-PCR鑒定SKOV3和3AO細胞株GADD45的表達。
1.9 親本細胞SKOV3和3AO誘導 在超凈臺內(nèi)，用紫外線燈消毒，距離待測細胞20cm，垂直照射8min，5%CO2、37℃培養(yǎng)6～8h。RT-PCR測定其GADD45表達。
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1.10 轉染細胞的誘導 用不同濃度的足葉己甙(VP16)誘導后，于5%CO2、37℃培養(yǎng)24h，測定細胞凋亡指標。
1.11 細胞凋亡測定 ①碘化丙錠(PI)熒光染色流式細胞儀(FCM)分析細胞凋亡；②DNA“l(fā)adder”的測定：收集約5×106待檢細胞，用細胞裂解液(1%NP40、20mmol EDTA pH8.0、50mmol Tris.Cl pH7.5)裂解，蛋白酶K消化，提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80V，2～3h)后觀察結果。
2 結果
2.1 SKOV3和3AO細胞株，誘導后經(jīng)RT-PCR鑒定缺乏GADD45基因的表達。
2.2 Western Blot檢測SKOV3和3AO細胞株野生型p53蛋白表達結果 SKOV3表達陽性；3AO為陰性，見照片1。
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2.3 重組質粒pcDNA-GADD45經(jīng)Not-1和Kpn-1雙酶切鑒定 在1.4kbp處可見一條帶，重組成功，見照片2。
2.4 RT-PCR檢測轉染GADD45基因的SKOV3和3AO細胞株經(jīng)誘導后GADD45的表達，SKOV3-GADD45表達陽性；3AO-GADD45表達陰性，見照片3。
照片1 Western Blot測定SKOV3和3AO細胞株p35蛋白表達結果
1：SKOV3細胞株蛋白 2：3AO細胞株蛋白
照片2 pCDNA-GADD45酶切鑒定結果
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1：pCDNA-GADD45經(jīng)Kpn-Ⅰ和Not-Ⅰ雙酶切產(chǎn)物可見在1.4kb處有一條帶
2：PBR322/BSTN-Ⅰ marker
2.5 細胞凋亡測定 ①FCM分析結果：轉染GADD45基因的細胞，經(jīng)80μg/ml、160μg/ml的VP16誘導在培養(yǎng)24h后,SKOV3細胞株可出現(xiàn)G1期延長及細胞凋亡峰，3AO細胞株無明顯的G1期延長及細胞凋亡峰出現(xiàn)。對照組和空白對照組均無G1期延長和細胞凋亡峰出現(xiàn)；②DNA“l(fā)adder”測定 轉染GADD45基因的細胞經(jīng)VP16 80μg/ml誘導，培養(yǎng)24h后，SKOV3細胞株可出現(xiàn)DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)，見照片4。3AO細胞株則無DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)。對照組和空白對照組均未出現(xiàn)DNA“l(fā)adder”的表現(xiàn)。
照片3 經(jīng)UV誘導的SKOV3-GADD45，3AO-GADD45，RT-PCR鑒定結果
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1：3AO-GADD45 RT-PCR產(chǎn)物未見有條帶
2：SKOV3-GADD45 RT-PCR產(chǎn)物可見在1.4kbp處有一條帶
M：PBR322/BSTN-Ⅰ marker
照片4 VP16誘導SKOV3-GADD45細胞凋亡DNA“l(fā)adder” 1、2、3、4：不同濃度的VP16誘導培養(yǎng)24h 5、6：80μg/ml、160μg/ml的VP16培養(yǎng)24h
3 討論
GADD基因組是在研究腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉歸過程中涌出的新發(fā)現(xiàn)，可在DNA損傷因素的作用下，發(fā)揮使細胞生長受抑和凋亡的作用[1]。
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本實驗結果表明，經(jīng)RT-PCR鑒定無GADD45基因表達的OC細胞株SKOV3和3AO，和轉入pcDNA-Ⅲ空質粒的SKOV3和3AO細胞株，經(jīng)過VP16以及UV的誘導，均無G1期延長和細胞凋亡。而轉入GADD45基因的SKOV3細胞株，誘導后G1期延長，并且進入細胞凋亡的狀態(tài)。細胞凋亡與細胞增殖、分化一樣，是一個級聯(lián)式的基因表達結果。這一過程有許多癌基因和抑癌基因參與。GADD基因的表達可使細胞生長抑制在G1/G0期，或使腫瘤出現(xiàn)細胞凋亡[2]。在GADD基因表達缺失及在相關基因的作用下，細胞失控，使細胞增殖和抑制發(fā)生偏離，可能是組織發(fā)生腫瘤的原因之一。 Slichenmyer等[3]指出：GADD45是依賴于野生型p53作用的蛋白，它在腫瘤細胞凋亡中所起的級聯(lián)橋梁作用是依賴p53途徑實現(xiàn)的。在p53所致細胞凋亡和生長抑制的基因級聯(lián)中，直接受p53調(diào)控，是連接p53和下一級細胞凋亡相關的重要中間環(huán)節(jié)，由此提示：p53的表達產(chǎn)物是GADD45的調(diào)節(jié)蛋白。
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本研究結果還表明，通過轉染GADD45基因的SKOV3和3AO并篩選為陽性的細胞株，經(jīng)FCM分析提示：SKOV3細胞株出現(xiàn)G1期延長和細胞凋亡狀態(tài)；而3AO細胞株無G1期延長和凋亡。經(jīng)過Western Blot鑒定；SKOV3細胞株有p53蛋白表達；3AO細胞株缺乏p53蛋白的表達。故本實驗證實GADD45對腫瘤細胞的作用是依賴于正常p53的功能。在DNA損傷的應答中，損傷因子是通過一個轉錄后機制誘導野生型p53表達，阻斷細胞周期，使損傷DNA得以修復[4]。這是因為p53蛋白產(chǎn)物可以延長細胞周期的進程，使細胞停滯于DNA復制啟動之前，或復制之時。當腫瘤細胞轉染GADD45基因，此基因的表達使DNA的損傷不可能恢復，而使細胞改道進入程序化死亡途徑[5]。
參考文獻
1.Hollander MC，Alamc I，et al.Analysis of the mammalian GADD45 gene and its response to DNA damage J BiolChem 1993；15：268(32)：2438
, http://www.www.srpcoatings.com
2.Fornace A，Alamo I， et al.DNA damage inducible transcripts in mammalinan cell.Proc Natl Acad Sci USA 1988;85：8800
3.Slichenmyer WJ，Nelsos WJ，et al. Loss of a p53 associated Gl checkpoint does not decrease all survival following DNA damege.Cancer Res 1993；53：4164
4.Miyashita T，Harigai M，et al.Identification of a p53-dependent negative response element in the bcl-2 gene.Cancer Res 1994；54；3131
5.Fornace A，Alamo I，et al.DNA damage-inducible transcripts in mammalinan cells.Proc Natl Acad Sci USA 1988；85：8800
(收稿日期 1998-06-20), 百拇醫(yī)藥