高效毛細管電泳法測定肌苷注射液含量
作者：劉莉 張國棟
單位：劉莉(江蘇徐州市藥品檢驗所 徐州 221006)；張國棟(北京醫(yī)科大學分析化學教研室 北京 100083)
關鍵詞：
藥物分析雜志000333 肌苷為輔酶類藥物，它能參與體內(nèi)能量代謝及蛋白質(zhì)的合成，具有提高各種酶(特別是輔酶A)的活性及改善機體代謝作用。其注射液加苯甲酸鈉作助溶劑，不能直接用紫外分光光度法測肌苷含量，部頒標準采用紙層析-紫外分光光度法[1]測定含量，操作復雜，費時，且重現(xiàn)性差。文獻報道有HPLC法[2]、差示分光光度法[3]、旋光度法[4]、比色法[5]和轉(zhuǎn)換曲線分光光度法[6]測定肌苷注射液含量。本文選用合適內(nèi)標，采用高效毛細管電泳法同時測定肌苷和苯甲酸鈉的含量，該法操作簡單、快速，結果準確。
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1 儀器與試藥
CE-232型毛細管電泳儀(北京大學化學系)，島津UV-260分光光度計，肌苷(純度為99.9%)、苯甲酸鈉(純度為99.5%)對照品均由淮陰和平生物化工廠提供；對氨基苯甲酸(內(nèi)標)為中國藥品生物制品檢定所發(fā)對照品；肌苷注射液(北京永康制藥廠，批號：990315，981026，980814，規(guī)格：100 mg∶2 mL);其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。
2 測定條件
未涂層石英毛細管柱(75 μm×39 cm)，有效長度30 cm，河北永年光導纖維廠；柱溫20 ℃；檢測波長254 nm；運行緩沖液：20 mmol.L-1硼酸鈉溶液-20 mmol.L-1磷酸緩沖液(36∶64,pH=6.1)；進樣：壓力進樣10 s，運行電壓15 kV；運行緩沖液和供試液均需經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后使用；每次進樣前分別用0.1 mmol.L-1氫氧化鈉溶液，運行緩沖液各沖洗2 min。
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3 溶液的配制
3.1 對照品貯備液的配制 精密稱取對照品肌苷100 mg，苯甲酸鈉100.7 mg，置100 mL量瓶中加水適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。
3.2 內(nèi)標貯備液的配制 精密稱取對氨基苯甲酸21.6 mg, 置50 mL量瓶中加水適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。
3.3 樣品貯備液的配制 精密量取肌苷注射液1 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。
4 方法與結果
4.1 標準曲線與線性范圍 精密量取對照品貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，各加內(nèi)標貯備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。分別進樣測定峰面積。每一標準液進樣5次，測定峰面積，取平均值。以對照品與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，相應對照品濃度(mg.mL-1)為橫坐標，進行線性回歸。肌苷和苯甲酸鈉的回歸方程分別為：
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Y＝4.668 9C+0.206 1 r=0.999 5
Y＝13.329 0C+0.473 6 r=0.999 7
定量線性范圍均為0.1～0.5 mg.mL-1。
4.2 回收率實驗 精密量取對照品貯備液1.5 mL和已測得含量的樣品貯備液1.5 mL，再加內(nèi)標貯備液1 mL，置10 mL量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻。進樣測定5份，結果表明：肌苷及苯甲酸鈉的平均回收率分別為100.9%(RSD為1.6%)和99.3%(RSD為1.2%),n=5。
4.3 樣品測定 精密量取樣品貯備液3 mL置10 mL量瓶中，加內(nèi)標貯備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。進樣5次。典型電泳圖見圖1。測得峰面積與內(nèi)標峰面積之比的平均值代入標準曲線方程，計算肌苷的百分標示含量與苯甲酸鈉的百分含量。同時與部頒標準法[1]比較，結果基本一致。見表1。
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圖1 肌苷注射液的電泳分離圖
1.肌苷 2.對氨基苯甲酸 3.苯甲酸鈉
表1 樣品含量測定結果(%,n=5)
毛細管電泳法
部頒標準法
樣品
肌苷
苯甲酸鈉
肌苷
990315
93.5 (1.4)
4.407(0.9)
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93.1(2.4)
981026
95.1 (1.2)
4.361(1.1)
95.3(1.8)
980814
94.6 (0.9)
4.526 (1.3)
94.0(2.1)
注：括號內(nèi)為RSD(%)
5 討論
5.1 緩沖液pH的選擇 在pH 4.5～7.0 范圍內(nèi)考察了肌苷和苯甲酸鈉電泳的分離情況。當pH>6.1時，峰形隨pH升高而前伸；pH<6.1時，峰形隨pH降低而拖尾；pH=6.1時各峰峰形好，且分離度合適。故選pH=6.1。
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5.2 內(nèi)標的選擇 對安替比林、對乙酰氨基酚、對氨基苯甲酸電泳行為進行了考察，發(fā)現(xiàn)在本文條件下，安替比林、對乙酰氨基酚與肌苷不能達到基線分離，只有對氨基苯甲酸的遷移率介于組分峰之間，樣品測定無干擾，且峰形良好，故選擇對氨基苯甲酸作為內(nèi)標。
5.3 運行電壓的選擇 升高運行電壓可以加快分析速度，一定范圍內(nèi)提高電泳分離效能，實驗中比較了運行電壓8～19 kV范圍內(nèi)各組分的遷移時間和分離效能的變化規(guī)律，最終選擇了15 kV運行電壓不僅有高柱效，而且大大縮短分析時間。
參考文獻
1，衛(wèi)生部藥品標準.生化藥品(第一冊).1989. 8
2，王董民，王曉瓊.高效液相色譜法測定肌苷注射液中肌苷和苯甲酸鈉的含量.藥物分析雜志，1993，13(5)：331
3，陳煒.差示分光光度法測定肌苷注射液含量.藥物分析雜志，1993，13(1)：42
4，洪煜.旋光度法測定肌苷注射液的含量.藥物分析雜志，1994，14(4)：55
5，代勇.肌苷注射液的比色法測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，25(5)：224
6，董亞琳，魏友霞，馬玉英等.轉(zhuǎn)換曲線分光光度法測定肌苷注射液含量.中國醫(yī)院藥學雜志，1998，18(10)：461
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇醫(yī)藥
單位：劉莉(江蘇徐州市藥品檢驗所 徐州 221006)；張國棟(北京醫(yī)科大學分析化學教研室 北京 100083)
關鍵詞：
藥物分析雜志000333 肌苷為輔酶類藥物，它能參與體內(nèi)能量代謝及蛋白質(zhì)的合成，具有提高各種酶(特別是輔酶A)的活性及改善機體代謝作用。其注射液加苯甲酸鈉作助溶劑，不能直接用紫外分光光度法測肌苷含量，部頒標準采用紙層析-紫外分光光度法[1]測定含量，操作復雜，費時，且重現(xiàn)性差。文獻報道有HPLC法[2]、差示分光光度法[3]、旋光度法[4]、比色法[5]和轉(zhuǎn)換曲線分光光度法[6]測定肌苷注射液含量。本文選用合適內(nèi)標，采用高效毛細管電泳法同時測定肌苷和苯甲酸鈉的含量，該法操作簡單、快速，結果準確。
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1 儀器與試藥
CE-232型毛細管電泳儀(北京大學化學系)，島津UV-260分光光度計，肌苷(純度為99.9%)、苯甲酸鈉(純度為99.5%)對照品均由淮陰和平生物化工廠提供；對氨基苯甲酸(內(nèi)標)為中國藥品生物制品檢定所發(fā)對照品；肌苷注射液(北京永康制藥廠，批號：990315，981026，980814，規(guī)格：100 mg∶2 mL);其他試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。
2 測定條件
未涂層石英毛細管柱(75 μm×39 cm)，有效長度30 cm，河北永年光導纖維廠；柱溫20 ℃；檢測波長254 nm；運行緩沖液：20 mmol.L-1硼酸鈉溶液-20 mmol.L-1磷酸緩沖液(36∶64,pH=6.1)；進樣：壓力進樣10 s，運行電壓15 kV；運行緩沖液和供試液均需經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾后使用；每次進樣前分別用0.1 mmol.L-1氫氧化鈉溶液，運行緩沖液各沖洗2 min。
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3 溶液的配制
3.1 對照品貯備液的配制 精密稱取對照品肌苷100 mg，苯甲酸鈉100.7 mg，置100 mL量瓶中加水適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。
3.2 內(nèi)標貯備液的配制 精密稱取對氨基苯甲酸21.6 mg, 置50 mL量瓶中加水適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。
3.3 樣品貯備液的配制 精密量取肌苷注射液1 mL置50 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。
4 方法與結果
4.1 標準曲線與線性范圍 精密量取對照品貯備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，各加內(nèi)標貯備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。分別進樣測定峰面積。每一標準液進樣5次，測定峰面積，取平均值。以對照品與內(nèi)標的峰面積比為縱坐標，相應對照品濃度(mg.mL-1)為橫坐標，進行線性回歸。肌苷和苯甲酸鈉的回歸方程分別為：
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Y＝4.668 9C+0.206 1 r=0.999 5
Y＝13.329 0C+0.473 6 r=0.999 7
定量線性范圍均為0.1～0.5 mg.mL-1。
4.2 回收率實驗 精密量取對照品貯備液1.5 mL和已測得含量的樣品貯備液1.5 mL，再加內(nèi)標貯備液1 mL，置10 mL量瓶中用水稀釋至刻度，搖勻。進樣測定5份，結果表明：肌苷及苯甲酸鈉的平均回收率分別為100.9%(RSD為1.6%)和99.3%(RSD為1.2%),n=5。
4.3 樣品測定 精密量取樣品貯備液3 mL置10 mL量瓶中，加內(nèi)標貯備液1 mL，用水稀釋至刻度，搖勻。進樣5次。典型電泳圖見圖1。測得峰面積與內(nèi)標峰面積之比的平均值代入標準曲線方程，計算肌苷的百分標示含量與苯甲酸鈉的百分含量。同時與部頒標準法[1]比較，結果基本一致。見表1。
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圖1 肌苷注射液的電泳分離圖
1.肌苷 2.對氨基苯甲酸 3.苯甲酸鈉
表1 樣品含量測定結果(%,n=5)
毛細管電泳法
部頒標準法
樣品
肌苷
苯甲酸鈉
肌苷
990315
93.5 (1.4)
4.407(0.9)
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93.1(2.4)
981026
95.1 (1.2)
4.361(1.1)
95.3(1.8)
980814
94.6 (0.9)
4.526 (1.3)
94.0(2.1)
注：括號內(nèi)為RSD(%)
5 討論
5.1 緩沖液pH的選擇 在pH 4.5～7.0 范圍內(nèi)考察了肌苷和苯甲酸鈉電泳的分離情況。當pH>6.1時，峰形隨pH升高而前伸；pH<6.1時，峰形隨pH降低而拖尾；pH=6.1時各峰峰形好，且分離度合適。故選pH=6.1。
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5.2 內(nèi)標的選擇 對安替比林、對乙酰氨基酚、對氨基苯甲酸電泳行為進行了考察，發(fā)現(xiàn)在本文條件下，安替比林、對乙酰氨基酚與肌苷不能達到基線分離，只有對氨基苯甲酸的遷移率介于組分峰之間，樣品測定無干擾，且峰形良好，故選擇對氨基苯甲酸作為內(nèi)標。
5.3 運行電壓的選擇 升高運行電壓可以加快分析速度，一定范圍內(nèi)提高電泳分離效能，實驗中比較了運行電壓8～19 kV范圍內(nèi)各組分的遷移時間和分離效能的變化規(guī)律，最終選擇了15 kV運行電壓不僅有高柱效，而且大大縮短分析時間。
參考文獻
1，衛(wèi)生部藥品標準.生化藥品(第一冊).1989. 8
2，王董民，王曉瓊.高效液相色譜法測定肌苷注射液中肌苷和苯甲酸鈉的含量.藥物分析雜志，1993，13(5)：331
3，陳煒.差示分光光度法測定肌苷注射液含量.藥物分析雜志，1993，13(1)：42
4，洪煜.旋光度法測定肌苷注射液的含量.藥物分析雜志，1994，14(4)：55
5，代勇.肌苷注射液的比色法測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，1994，25(5)：224
6，董亞琳，魏友霞，馬玉英等.轉(zhuǎn)換曲線分光光度法測定肌苷注射液含量.中國醫(yī)院藥學雜志，1998，18(10)：461
(本文于2000年3月17日修改回), 百拇醫(yī)藥