乳果糖口服液含量的HPLC測定法研究
作者：周立春 紀(jì)宏
單位：周立春 紀(jì)宏(北京市藥品檢驗(yàn)所 100035)
關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；乳果糖；有關(guān)物質(zhì)；氨基柱
藥物分析雜志000312 摘要 目的：建立一種乳果糖口服液含量的反相高效液相色譜測定法。方法：氨基柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈(19∶81)為流動相，流速1.8 mL.min-1，檢測器：示差折光檢測器。結(jié)果：線性范圍：50～400 μg,r=0.999 9，回收率為100.0%，RSD為1.0%(n=5)。結(jié)論：本方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為乳果糖口服液提供有效的質(zhì)量控制方法。
Development of HPLC Method for Lactulose Oral Solution Assay
, 百拇醫(yī)藥
Zhou Lichun，Ji Hong
(Municipal Institute for Drug Control,Beijing 100035)
Abstract Objective：A HPLC method was described for the determination of lactulose.Method:NH2 column,with a mixture of acetonitrile-phosphate buffer(81∶19) pH 6 as mobile phase.The refractive index detector was used. Results:The standard curve was linear in the range of 50～400 μg of lactulose(r=0.999 9).The average recovery of lactulose was 100.0%(n=5),RSD=1.0%.Conclusions:The established method is rapid,accurate and reliable.This method is significant for the quality control of lactulose and its relative substances.
, 百拇醫(yī)藥
Key words RP-HPLC，lactulose,relative substances,NH2 column
乳果糖口服液是中國藥典1995年版新增品種，主要用于治療肝昏迷， 還可用于治療慢性功能性便秘。由于生產(chǎn)工藝條件所限，乳果糖的純度接近90%，其相關(guān)物質(zhì)，主要為乳糖、半乳糖和果糖。中國藥典(1995年版)[1]中，檢測乳果糖口服液的有關(guān)物質(zhì)及含量測定的方法為高效液相色譜法，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水(77∶23)為流動相，以示差折光檢測器測定。但試驗(yàn)表明(見色譜圖1-A)，該方法不能將乳果糖與其有關(guān)物質(zhì)完全分離。本文采用以氨基鍵合硅膠為填充劑，乙腈-磷酸鹽緩沖液(81∶19)為流動相，以示差折光檢測器測定，使乳果糖與其有關(guān)物質(zhì)完全分離(見色譜圖1-B)，達(dá)到對乳果糖及其有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量的有效控制。
1 儀器與試藥
, 百拇醫(yī)藥 高效液相色譜儀，日本島津LC-6A高壓泵，RID-6A檢測器，C-R4A色譜工作站，以上由SCL-6A系統(tǒng)控制器聯(lián)機(jī)監(jiān)控，RHEODYNE 7161型進(jìn)樣閥；METTLER AE 260型電子分析天平。
乳果糖(純度為100.0%)、果糖、半乳糖、乳糖對照品和乳果糖口服液(規(guī)格為5 g∶10 mL)，由北京集愛制藥公司提供；乙腈為色譜純試劑，磷酸二氫鈉為分析純試劑。
2 色譜條件
色譜柱：Phenomenex,Nucleosil 5 NH2 100 A氨基鍵合硅膠色譜柱(10 μm,250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0；流速：1.8 mL.min-1；檢測器：示差折光檢測器；檢測靈敏度：0.1 AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，乳果糖的保留時間約為17 min，在樣品的色譜圖中乳果糖與其最近的雜質(zhì)峰得到基線分離，分離度大于1.5。見圖1-B。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 中國藥典法(A)與本法(B)條件下色譜圖
1.果糖 2.半乳糖 3.乳果糖 4.乳糖
3 線性關(guān)系
取乳果糖對照品適量，精密稱定，加流動相制成40 mg.mL-1的對照品溶液，精密量取上述溶液1.25，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，以乳果糖的量(μg)為橫坐標(biāo)，以乳果糖的峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為：
Y=5.182X-38.46 r=0.999 9
結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時，乳果糖在5～40 mg.mL-1濃度范圍內(nèi)，乳果糖的量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
, http://www.www.srpcoatings.com
4 樣品的測定
取乳果糖對照品約500 mg、果糖對照品約180 mg、半乳糖對照品約100 mg和乳糖對照品約20 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取乳果糖口服液，精密稱取適量(約相當(dāng)于乳果糖500 mg)，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，計算，即得。批號為971018，971021，971007的樣品含量(標(biāo)示量%)測定結(jié)果分別為104.5%、103.1%、102.3%，n=2。
5 回收試驗(yàn)
精密稱取乳果糖口服液適量(約相當(dāng)于乳果糖250 mg)，置25 mL量瓶中，再分別加入精密稱定的乳果糖對照品約250 mg，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。按色譜條件下方法測定，計算回收率，其平均回收率為100.0%，RSD為1.0%，n=5，說明輔料對含量測定基本無干擾，方法可行。
, http://www.www.srpcoatings.com
6 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取濃度為20 mg.mL-1的供試品溶液，進(jìn)樣5次，計算峰面積的RSD值，結(jié)果小于1%。
7 討論
7.1 色譜條件的選擇
7.1.1 流動相的選擇 經(jīng)試驗(yàn)，以乙腈與0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液二元系統(tǒng)作流動相，其中乙腈的比例對乳果糖的保留時間及與雜質(zhì)的分離程度有一定的影響，經(jīng)比較，選定乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)為流動相的配比。二元流動相系統(tǒng)的比例可根據(jù)色譜柱的具體情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。乙腈量的增加與保留時間的增加成正比。
7.1.2 流動相的pH對色譜行為的影響 在乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)的條件下，以磷酸調(diào)節(jié)pH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品的保留時間隨pH的升高而增加，乳果糖與相近有關(guān)物質(zhì)的分離度隨pH的升高而增加，但pH的升高到一定程度，將對色譜柱有破壞作用，當(dāng)pH為6.0時，分離效果較佳，樣品的保留時間及測定時間適中，且能有效地保護(hù)色譜柱。
, 百拇醫(yī)藥
7.1.3 柱溫對色譜行為的影響 經(jīng)試驗(yàn)表明，樣品的保留時間隨柱溫的升高而略有減少，分離度略有增加，通過試驗(yàn)認(rèn)為，室溫條件下，能保證分離效果，又可降低對儀器條件的要求。
7.1.4 分離柱的選擇 本文選擇了對糖類分離首選的氨基鍵合硅膠色譜柱作為分離柱。對國內(nèi)、外數(shù)種牌號的分離柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明，乳果糖在不同牌號的氨基鍵合硅膠柱上均可達(dá)到藥典規(guī)定的分離度，必要時可適當(dāng)調(diào)整二元流動相的比例。
7.2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 照本法配制的對照品溶液及供試品溶液在24 h之內(nèi)進(jìn)行測定，溶液穩(wěn)定，結(jié)果無顯著變化。
7.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論塔板數(shù)按乳果糖峰計算應(yīng)不低于2 000，同一對照品溶液重復(fù)注射5次，峰面積的RSD小于1%，乳果糖峰的拖尾因子小于1.5，與其最近雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
參考文獻(xiàn)
1，中國藥典.1995.二部：397
(本文于1999年2月23日收到), 百拇醫(yī)藥
單位：周立春 紀(jì)宏(北京市藥品檢驗(yàn)所 100035)
關(guān)鍵詞：反相高效液相色譜法；乳果糖；有關(guān)物質(zhì)；氨基柱
藥物分析雜志000312 摘要 目的：建立一種乳果糖口服液含量的反相高效液相色譜測定法。方法：氨基柱，以磷酸鹽緩沖液-乙腈(19∶81)為流動相，流速1.8 mL.min-1，檢測器：示差折光檢測器。結(jié)果：線性范圍：50～400 μg,r=0.999 9，回收率為100.0%，RSD為1.0%(n=5)。結(jié)論：本方法結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，為乳果糖口服液提供有效的質(zhì)量控制方法。
Development of HPLC Method for Lactulose Oral Solution Assay
, 百拇醫(yī)藥
Zhou Lichun，Ji Hong
(Municipal Institute for Drug Control,Beijing 100035)
Abstract Objective：A HPLC method was described for the determination of lactulose.Method:NH2 column,with a mixture of acetonitrile-phosphate buffer(81∶19) pH 6 as mobile phase.The refractive index detector was used. Results:The standard curve was linear in the range of 50～400 μg of lactulose(r=0.999 9).The average recovery of lactulose was 100.0%(n=5),RSD=1.0%.Conclusions:The established method is rapid,accurate and reliable.This method is significant for the quality control of lactulose and its relative substances.
, 百拇醫(yī)藥
Key words RP-HPLC，lactulose,relative substances,NH2 column
乳果糖口服液是中國藥典1995年版新增品種，主要用于治療肝昏迷， 還可用于治療慢性功能性便秘。由于生產(chǎn)工藝條件所限，乳果糖的純度接近90%，其相關(guān)物質(zhì)，主要為乳糖、半乳糖和果糖。中國藥典(1995年版)[1]中，檢測乳果糖口服液的有關(guān)物質(zhì)及含量測定的方法為高效液相色譜法，采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-水(77∶23)為流動相，以示差折光檢測器測定。但試驗(yàn)表明(見色譜圖1-A)，該方法不能將乳果糖與其有關(guān)物質(zhì)完全分離。本文采用以氨基鍵合硅膠為填充劑，乙腈-磷酸鹽緩沖液(81∶19)為流動相，以示差折光檢測器測定，使乳果糖與其有關(guān)物質(zhì)完全分離(見色譜圖1-B)，達(dá)到對乳果糖及其有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量的有效控制。
1 儀器與試藥
, 百拇醫(yī)藥 高效液相色譜儀，日本島津LC-6A高壓泵，RID-6A檢測器，C-R4A色譜工作站，以上由SCL-6A系統(tǒng)控制器聯(lián)機(jī)監(jiān)控，RHEODYNE 7161型進(jìn)樣閥；METTLER AE 260型電子分析天平。
乳果糖(純度為100.0%)、果糖、半乳糖、乳糖對照品和乳果糖口服液(規(guī)格為5 g∶10 mL)，由北京集愛制藥公司提供；乙腈為色譜純試劑，磷酸二氫鈉為分析純試劑。
2 色譜條件
色譜柱：Phenomenex,Nucleosil 5 NH2 100 A氨基鍵合硅膠色譜柱(10 μm,250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)，用稀磷酸調(diào)節(jié)pH至6.0；流速：1.8 mL.min-1；檢測器：示差折光檢測器；檢測靈敏度：0.1 AUFS；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，乳果糖的保留時間約為17 min，在樣品的色譜圖中乳果糖與其最近的雜質(zhì)峰得到基線分離，分離度大于1.5。見圖1-B。
, 百拇醫(yī)藥
圖1 中國藥典法(A)與本法(B)條件下色譜圖
1.果糖 2.半乳糖 3.乳果糖 4.乳糖
3 線性關(guān)系
取乳果糖對照品適量，精密稱定，加流動相制成40 mg.mL-1的對照品溶液，精密量取上述溶液1.25，2.5，5.0，7.5，10.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣10 μL，以乳果糖的量(μg)為橫坐標(biāo)，以乳果糖的峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程為：
Y=5.182X-38.46 r=0.999 9
結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為10 μL時，乳果糖在5～40 mg.mL-1濃度范圍內(nèi)，乳果糖的量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。
, http://www.www.srpcoatings.com
4 樣品的測定
取乳果糖對照品約500 mg、果糖對照品約180 mg、半乳糖對照品約100 mg和乳糖對照品約20 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取乳果糖口服液，精密稱取適量(約相當(dāng)于乳果糖500 mg)，置25 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，計算，即得。批號為971018，971021，971007的樣品含量(標(biāo)示量%)測定結(jié)果分別為104.5%、103.1%、102.3%，n=2。
5 回收試驗(yàn)
精密稱取乳果糖口服液適量(約相當(dāng)于乳果糖250 mg)，置25 mL量瓶中，再分別加入精密稱定的乳果糖對照品約250 mg，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。按色譜條件下方法測定，計算回收率，其平均回收率為100.0%，RSD為1.0%，n=5，說明輔料對含量測定基本無干擾，方法可行。
, http://www.www.srpcoatings.com
6 重現(xiàn)性試驗(yàn)
取濃度為20 mg.mL-1的供試品溶液，進(jìn)樣5次，計算峰面積的RSD值，結(jié)果小于1%。
7 討論
7.1 色譜條件的選擇
7.1.1 流動相的選擇 經(jīng)試驗(yàn)，以乙腈與0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液二元系統(tǒng)作流動相，其中乙腈的比例對乳果糖的保留時間及與雜質(zhì)的分離程度有一定的影響，經(jīng)比較，選定乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)為流動相的配比。二元流動相系統(tǒng)的比例可根據(jù)色譜柱的具體情況進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)。乙腈量的增加與保留時間的增加成正比。
7.1.2 流動相的pH對色譜行為的影響 在乙腈-0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉溶液(81∶19)的條件下，以磷酸調(diào)節(jié)pH，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品的保留時間隨pH的升高而增加，乳果糖與相近有關(guān)物質(zhì)的分離度隨pH的升高而增加，但pH的升高到一定程度，將對色譜柱有破壞作用，當(dāng)pH為6.0時，分離效果較佳，樣品的保留時間及測定時間適中，且能有效地保護(hù)色譜柱。
, 百拇醫(yī)藥
7.1.3 柱溫對色譜行為的影響 經(jīng)試驗(yàn)表明，樣品的保留時間隨柱溫的升高而略有減少，分離度略有增加，通過試驗(yàn)認(rèn)為，室溫條件下，能保證分離效果，又可降低對儀器條件的要求。
7.1.4 分離柱的選擇 本文選擇了對糖類分離首選的氨基鍵合硅膠色譜柱作為分離柱。對國內(nèi)、外數(shù)種牌號的分離柱進(jìn)行比較，結(jié)果表明，乳果糖在不同牌號的氨基鍵合硅膠柱上均可達(dá)到藥典規(guī)定的分離度，必要時可適當(dāng)調(diào)整二元流動相的比例。
7.2 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 照本法配制的對照品溶液及供試品溶液在24 h之內(nèi)進(jìn)行測定，溶液穩(wěn)定，結(jié)果無顯著變化。
7.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 理論塔板數(shù)按乳果糖峰計算應(yīng)不低于2 000，同一對照品溶液重復(fù)注射5次，峰面積的RSD小于1%，乳果糖峰的拖尾因子小于1.5，與其最近雜質(zhì)峰的分離度大于1.5。
參考文獻(xiàn)
1，中國藥典.1995.二部：397
(本文于1999年2月23日收到), 百拇醫(yī)藥