ICAM-1系統(tǒng)在異位性皮炎發(fā)病中的意義
作者:尹興平 唱文娟 張開明
單位:太原市中心醫(yī)院(030009)尹興平 唱文娟 張開明
關(guān)鍵詞:異位性皮炎;ICAM-1;sICAM-1
論著
摘 要 為了解ICAM-1系統(tǒng)在異位性皮炎(AD)發(fā)病中的作用,采用ELISA和免疫組化技術(shù)對(duì)AD患者的血清、皮損、外周血PBMC的sICAM-1含量及ICAM-1表達(dá)進(jìn)行了綜合研究。結(jié)果顯示:①AD患者血清sICAM-1含量顯著高于對(duì)照組,而每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩組間無(wú)明顯差異;②11例皮損中ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性者共6例, 主要位于基底層角蛋白細(xì)胞和真皮浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞表面,9例對(duì)照標(biāo)本僅2例基底角蛋白細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。提示AD發(fā)病與ICAM-1系統(tǒng)有密切的關(guān)系。
近年有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1與變應(yīng)性皮膚病發(fā)病密切相關(guān),為此我們采用ELISA、免疫組化技術(shù)檢測(cè)了異位性皮炎(AD)患者血清sICAM-1含量及皮損、外周血PBMCICAM-1的表達(dá)水平,以了解ICAM-1在AD發(fā)病中的變化及其可能的機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
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1 資料與方法
1.1 病例選擇取1997年10月—1998年1月我科門診及住院的AD患者 (2周內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑)共15例,發(fā)病年齡8歲~57歲。健康對(duì)照者17例,為與AD患者年齡相近,既往無(wú)任何變應(yīng)性疾病的志愿者。
1.2 試劑
sICAM-1ELISA試劑盒為比利時(shí)MEDGENIX產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液、APAAP試劑盒購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;鼠抗人ICAM-1單克隆抗體及免疫組化SPTM試劑盒為ZYMED公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京中山試劑公司。
1.3 標(biāo)本處理
取AD患者和健康對(duì)照者靜脈血5ml,3ml分離血清并-40℃凍存,待標(biāo)本累積夠既定例數(shù)后,一次性同步測(cè)定。2ml抗凝、分離PBMC并涂片。AD皮損標(biāo)本取自皮膚科5年以內(nèi)被確診為AD患者的石蠟切塊,健康對(duì)照皮膚標(biāo)本由我院手術(shù)科室提供。
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1.4 方法
1.4.1 APAAP橋聯(lián)酶標(biāo)法:①PBMC離心涂片后,丙酮固定,加稀釋度為1∶50鼠抗人ICAM-1單克隆抗體,室溫孵育;②PBS沖洗,加羊抗鼠IgG二抗,同前孵育、沖洗; ③加APAAP復(fù)合物同前孵育、沖洗;④加堿性磷酸酶底物液室溫顯色20min,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,水洗,封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)有核細(xì)胞,然后統(tǒng)計(jì)每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),陰性細(xì)胞表面可見紅色顆粒物。
1.4.2 血清sICAM-1含量測(cè)定采用ELISA法。主要操作步驟為:①待測(cè)標(biāo)本按1∶100稀釋,每孔加入25μl標(biāo)準(zhǔn)品、生理鹽水(空白)或稀釋標(biāo)本,均設(shè)復(fù)孔。再加入抗ICAM-1-HRP75μl/孔,室溫振蕩孵育120min;②棄去孔內(nèi)液體, 洗板,加底物液200μl/孔,避光,振蕩孵育30min;③加終止液50μl/孔終止反應(yīng); ④避光靜置30min后在Labsystem酶標(biāo)儀(芬蘭產(chǎn))上采用雙波長(zhǎng)(490nm,650nm)測(cè)定各孔吸光度值, 并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品吸光度值(復(fù)孔均值)查標(biāo)準(zhǔn)曲線并乘以100倍即可得到血清中sICAM1含量(μg/L)。
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1.4.3 皮損免疫組化:①石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。加3%過(guò)氧化氫孵育10min,蒸餾水沖洗,PBS浸泡,加10%正常山羊血清封閉10min;②加1∶50鼠抗人ICAM-1單克隆抗體4℃過(guò)夜;③PBS沖洗,滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30min;④PBS沖洗,加1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素同前孵育、沖洗,DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。 顯微鏡下觀察,ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性部位有棕黃色顆粒物沉積。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
利用本室微機(jī)的SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包,對(duì)血清sICAM-1含量和每100個(gè)PBMC中ICAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 AD患者血清sICAM-1含量明顯高于對(duì)照(P<0.001),而每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異,見表1。
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表1 AD患者血清ICAM-1含量和每100個(gè)
PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性數(shù)(±s)
組別
n
sICAM-1含量
細(xì)胞數(shù)
μg/L
個(gè)
正常
17
180.5±12.1
12.33±4.73
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AD組
15
274.7±87.51)
15.00±1.582)
注:與對(duì)照組比較 1)P<0.05 2)P>0.05
2.2 免疫組化研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)AD患者皮損基底層角蛋白細(xì)胞及真皮浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,而9例正常對(duì)照組僅2例基底角蛋白細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。
3 討論
ICAM-1又名CD54,屬于粘附受體免疫球蛋白超家族,是膜表面白細(xì)胞功能相關(guān)性抗原1即LFA-1整合素的一種配體,二者結(jié)合形成ICAM-1-LFA-1復(fù)合物在免疫反應(yīng)特別是免疫活化過(guò)程中起重要作用,介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)之間的粘附性。存在于血清和體中的循環(huán)ICAM-1即sICAM-1的來(lái)源說(shuō)法不一, 有人推測(cè)是膜ICAM-1經(jīng)蛋白裂解酶作用發(fā)生裂解、脫落形成的可溶性分子,有研究證實(shí)單個(gè)核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)特定條件下可合成該因子, 據(jù)此有人認(rèn)為sICAM-1可能是體內(nèi)細(xì)胞合成并分泌至胞外的生物介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)sICAM-1含有膜ICAM-1的大部分功能區(qū),因而有生物學(xué)活性,可與LFA-1結(jié)合。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD患者sICAM-1含量顯著高于正常人群,而PBMCICAM-1表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異, 由此推測(cè)sICAM-1含量增加不僅與PBMC活化有關(guān),活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞也參與該變化。Kowalzick等〔1〕對(duì)AD治療前后ICAM-1系統(tǒng)變化的結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。 盡管人們對(duì)sICAM-1在AD療效評(píng)價(jià)中的作用尚有爭(zhēng)議, 但sICAM-1可能競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗ICAM-1與LFA-1結(jié)合,阻斷由此介導(dǎo)的細(xì)胞之間的粘附性、發(fā)揮“抗炎”作用。
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Jung等〔2〕對(duì)AD皮損的免疫組化研究也發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)特別是基底角蛋白細(xì)胞和真皮浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。體外實(shí)驗(yàn)表明〔3〕多種細(xì)胞表面均有ICAM-1表達(dá)。且表達(dá)水平受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。由于推測(cè)AD皮損ICAM-1表達(dá)可能與參與免疫反應(yīng)的活化細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的差異〔4〕, CD+4細(xì)胞可分為TH1和TH2亞群,TH1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β,而TH2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。有研究發(fā)現(xiàn)AD皮損區(qū)浸潤(rùn)C(jī)D+4細(xì)胞主要是TH2亞群并且伴有TH2亞群擴(kuò)大。TH2在自分泌和肥大細(xì)胞〔5〕分泌的IL-4作用下,分泌多種細(xì)胞因子,刺激B細(xì)胞增殖,分化并合成IgE型抗體,進(jìn)而刺激肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的增長(zhǎng)、分化, 協(xié)同促進(jìn)變態(tài)反應(yīng),釋放炎癥介質(zhì)。在皮損局部生物學(xué)活性物質(zhì)的共同作用下,導(dǎo)致角蛋白細(xì)胞ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)。
, 百拇醫(yī)藥
綜上所述, AD患者血清sICAM-1和皮損局部ICAM-1表達(dá)均有明顯變化,ICAM-1系統(tǒng)參與其發(fā)病過(guò)程特別是免疫活化過(guò)程中細(xì)胞間信息傳遞、抗原遞呈以及炎癥細(xì)胞向炎癥部位的游走、趨化和聚集, 其中sICAM-1可能伴有抗炎作用。作為炎癥性皮膚病和其它疾病的一個(gè)非特異性指標(biāo),有關(guān)其在療效評(píng)價(jià)方面的作用留待進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
1 KowalzickL.Dermatology,1995,190(1):14
2 JungK.Allergy,1996,51(7):452
3 GrovesRW,AllenMH,RossEL[WTBX]etal.[WT][HT6]BrJDermatology,1995,132(3):345
4 洪建.上海免疫學(xué)雜志,1994,14(4):242
5 HorsmanneimoL,HarrimaIT,JalvikallioA[WTBX]etal.[WT][HT6]JDermatology,1994,131(3):348
(收稿日期:1998-09-28)
作者簡(jiǎn)介:尹興平,男,1970年8月生,主治醫(yī)師,太原市中心醫(yī)院,030009, 百拇醫(yī)藥
單位:太原市中心醫(yī)院(030009)尹興平 唱文娟 張開明
關(guān)鍵詞:異位性皮炎;ICAM-1;sICAM-1
論著
摘 要 為了解ICAM-1系統(tǒng)在異位性皮炎(AD)發(fā)病中的作用,采用ELISA和免疫組化技術(shù)對(duì)AD患者的血清、皮損、外周血PBMC的sICAM-1含量及ICAM-1表達(dá)進(jìn)行了綜合研究。結(jié)果顯示:①AD患者血清sICAM-1含量顯著高于對(duì)照組,而每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩組間無(wú)明顯差異;②11例皮損中ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性者共6例, 主要位于基底層角蛋白細(xì)胞和真皮浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞表面,9例對(duì)照標(biāo)本僅2例基底角蛋白細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。提示AD發(fā)病與ICAM-1系統(tǒng)有密切的關(guān)系。
近年有研究發(fā)現(xiàn)ICAM-1與變應(yīng)性皮膚病發(fā)病密切相關(guān),為此我們采用ELISA、免疫組化技術(shù)檢測(cè)了異位性皮炎(AD)患者血清sICAM-1含量及皮損、外周血PBMCICAM-1的表達(dá)水平,以了解ICAM-1在AD發(fā)病中的變化及其可能的機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。
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1 資料與方法
1.1 病例選擇取1997年10月—1998年1月我科門診及住院的AD患者 (2周內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)皮質(zhì)類固醇激素和免疫抑制劑)共15例,發(fā)病年齡8歲~57歲。健康對(duì)照者17例,為與AD患者年齡相近,既往無(wú)任何變應(yīng)性疾病的志愿者。
1.2 試劑
sICAM-1ELISA試劑盒為比利時(shí)MEDGENIX產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液、APAAP試劑盒購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所;鼠抗人ICAM-1單克隆抗體及免疫組化SPTM試劑盒為ZYMED公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京中山試劑公司。
1.3 標(biāo)本處理
取AD患者和健康對(duì)照者靜脈血5ml,3ml分離血清并-40℃凍存,待標(biāo)本累積夠既定例數(shù)后,一次性同步測(cè)定。2ml抗凝、分離PBMC并涂片。AD皮損標(biāo)本取自皮膚科5年以內(nèi)被確診為AD患者的石蠟切塊,健康對(duì)照皮膚標(biāo)本由我院手術(shù)科室提供。
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1.4 方法
1.4.1 APAAP橋聯(lián)酶標(biāo)法:①PBMC離心涂片后,丙酮固定,加稀釋度為1∶50鼠抗人ICAM-1單克隆抗體,室溫孵育;②PBS沖洗,加羊抗鼠IgG二抗,同前孵育、沖洗; ③加APAAP復(fù)合物同前孵育、沖洗;④加堿性磷酸酶底物液室溫顯色20min,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,水洗,封片。顯微鏡下計(jì)數(shù)300個(gè)有核細(xì)胞,然后統(tǒng)計(jì)每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),陰性細(xì)胞表面可見紅色顆粒物。
1.4.2 血清sICAM-1含量測(cè)定采用ELISA法。主要操作步驟為:①待測(cè)標(biāo)本按1∶100稀釋,每孔加入25μl標(biāo)準(zhǔn)品、生理鹽水(空白)或稀釋標(biāo)本,均設(shè)復(fù)孔。再加入抗ICAM-1-HRP75μl/孔,室溫振蕩孵育120min;②棄去孔內(nèi)液體, 洗板,加底物液200μl/孔,避光,振蕩孵育30min;③加終止液50μl/孔終止反應(yīng); ④避光靜置30min后在Labsystem酶標(biāo)儀(芬蘭產(chǎn))上采用雙波長(zhǎng)(490nm,650nm)測(cè)定各孔吸光度值, 并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品吸光度值(復(fù)孔均值)查標(biāo)準(zhǔn)曲線并乘以100倍即可得到血清中sICAM1含量(μg/L)。
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1.4.3 皮損免疫組化:①石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。加3%過(guò)氧化氫孵育10min,蒸餾水沖洗,PBS浸泡,加10%正常山羊血清封閉10min;②加1∶50鼠抗人ICAM-1單克隆抗體4℃過(guò)夜;③PBS沖洗,滴加生物素標(biāo)記二抗37℃孵育30min;④PBS沖洗,加1∶300辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素同前孵育、沖洗,DAB顯色、復(fù)染、脫水、透明、封片。 顯微鏡下觀察,ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性部位有棕黃色顆粒物沉積。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
利用本室微機(jī)的SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包,對(duì)血清sICAM-1含量和每100個(gè)PBMC中ICAM陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)經(jīng)方差分析后進(jìn)行t檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 AD患者血清sICAM-1含量明顯高于對(duì)照(P<0.001),而每100個(gè)PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異,見表1。
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表1 AD患者血清ICAM-1含量和每100個(gè)
PBMC中ICAM-1表達(dá)陽(yáng)性數(shù)(±s)
組別
n
sICAM-1含量
細(xì)胞數(shù)
μg/L
個(gè)
正常
17
180.5±12.1
12.33±4.73
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AD組
15
274.7±87.51)
15.00±1.582)
注:與對(duì)照組比較 1)P<0.05 2)P>0.05
2.2 免疫組化研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)AD患者皮損基底層角蛋白細(xì)胞及真皮浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性,而9例正常對(duì)照組僅2例基底角蛋白細(xì)胞呈弱陽(yáng)性。
3 討論
ICAM-1又名CD54,屬于粘附受體免疫球蛋白超家族,是膜表面白細(xì)胞功能相關(guān)性抗原1即LFA-1整合素的一種配體,二者結(jié)合形成ICAM-1-LFA-1復(fù)合物在免疫反應(yīng)特別是免疫活化過(guò)程中起重要作用,介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞、細(xì)胞—基質(zhì)之間的粘附性。存在于血清和體中的循環(huán)ICAM-1即sICAM-1的來(lái)源說(shuō)法不一, 有人推測(cè)是膜ICAM-1經(jīng)蛋白裂解酶作用發(fā)生裂解、脫落形成的可溶性分子,有研究證實(shí)單個(gè)核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)特定條件下可合成該因子, 據(jù)此有人認(rèn)為sICAM-1可能是體內(nèi)細(xì)胞合成并分泌至胞外的生物介質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)sICAM-1含有膜ICAM-1的大部分功能區(qū),因而有生物學(xué)活性,可與LFA-1結(jié)合。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AD患者sICAM-1含量顯著高于正常人群,而PBMCICAM-1表達(dá)陽(yáng)性率無(wú)明顯差異, 由此推測(cè)sICAM-1含量增加不僅與PBMC活化有關(guān),活化的血管內(nèi)皮細(xì)胞也參與該變化。Kowalzick等〔1〕對(duì)AD治療前后ICAM-1系統(tǒng)變化的結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)。 盡管人們對(duì)sICAM-1在AD療效評(píng)價(jià)中的作用尚有爭(zhēng)議, 但sICAM-1可能競(jìng)爭(zhēng)性地拮抗ICAM-1與LFA-1結(jié)合,阻斷由此介導(dǎo)的細(xì)胞之間的粘附性、發(fā)揮“抗炎”作用。
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Jung等〔2〕對(duì)AD皮損的免疫組化研究也發(fā)現(xiàn)皮損區(qū)特別是基底角蛋白細(xì)胞和真皮浸潤(rùn)炎癥細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性。體外實(shí)驗(yàn)表明〔3〕多種細(xì)胞表面均有ICAM-1表達(dá)。且表達(dá)水平受細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)。由于推測(cè)AD皮損ICAM-1表達(dá)可能與參與免疫反應(yīng)的活化細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的差異〔4〕, CD+4細(xì)胞可分為TH1和TH2亞群,TH1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β,而TH2分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10。有研究發(fā)現(xiàn)AD皮損區(qū)浸潤(rùn)C(jī)D+4細(xì)胞主要是TH2亞群并且伴有TH2亞群擴(kuò)大。TH2在自分泌和肥大細(xì)胞〔5〕分泌的IL-4作用下,分泌多種細(xì)胞因子,刺激B細(xì)胞增殖,分化并合成IgE型抗體,進(jìn)而刺激肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的增長(zhǎng)、分化, 協(xié)同促進(jìn)變態(tài)反應(yīng),釋放炎癥介質(zhì)。在皮損局部生物學(xué)活性物質(zhì)的共同作用下,導(dǎo)致角蛋白細(xì)胞ICAM-1表達(dá)明顯增強(qiáng)。
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綜上所述, AD患者血清sICAM-1和皮損局部ICAM-1表達(dá)均有明顯變化,ICAM-1系統(tǒng)參與其發(fā)病過(guò)程特別是免疫活化過(guò)程中細(xì)胞間信息傳遞、抗原遞呈以及炎癥細(xì)胞向炎癥部位的游走、趨化和聚集, 其中sICAM-1可能伴有抗炎作用。作為炎癥性皮膚病和其它疾病的一個(gè)非特異性指標(biāo),有關(guān)其在療效評(píng)價(jià)方面的作用留待進(jìn)一步研究。
參考文獻(xiàn)
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4 洪建.上海免疫學(xué)雜志,1994,14(4):242
5 HorsmanneimoL,HarrimaIT,JalvikallioA[WTBX]etal.[WT][HT6]JDermatology,1994,131(3):348
(收稿日期:1998-09-28)
作者簡(jiǎn)介:尹興平,男,1970年8月生,主治醫(yī)師,太原市中心醫(yī)院,030009, 百拇醫(yī)藥