一種新的DNA-DNA交聯(lián)檢測法——改良單細(xì)胞凝膠電泳法
作者：任澤舫 莊志雄 肖勇梅 張綿周 黃海雄 張丙堯
單位：肖勇梅(中山醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)；任澤舫 莊志雄 張綿周 黃海雄 張丙堯(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院深圳研究中心，518020)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000427 DNA交聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的嚴(yán)重事件，它影響DNA的正常復(fù)制功能，從而導(dǎo)致突變或腫瘤。多種致癌物質(zhì)和抗腫瘤藥物可引起DNA-DNA交聯(lián)，如砷、鎳、鉻、順鉑、絲裂酶素C等[1～4]。因此，檢測外環(huán)境因素所導(dǎo)致的DNA-DNA交聯(lián)是判斷其是否為誘變劑或致癌因素的有效手段。傳統(tǒng)檢測DNA交聯(lián)物的方法是堿洗脫法，但該法昂貴、耗時、操作復(fù)雜，并涉及到同位素[5]。發(fā)展新的DNA-DNA交聯(lián)物檢測方法實有必要。
單細(xì)胞凝膠電泳法是一種公認(rèn)的檢測DNA鏈斷裂的敏感、快速、簡便和廉價的方法[6]。在此基礎(chǔ)上，多位學(xué)者對其進(jìn)行了改良[7，8]，試圖將該法用于DNA交聯(lián)物的檢測。其改良的原理是在交聯(lián)劑作用細(xì)胞時用DNA斷裂劑作用，這樣，交聯(lián)劑就會減少后者所致的DNA斷裂后電泳的距離和量，與未加交聯(lián)劑相比，慧星尾部減少的長度等指標(biāo)與交聯(lián)物的量成正比。這些研究常用的DNA斷裂劑是甲基甲磺酸(MMS)和γ射線。Pfuhler等[7]采用MMS作為標(biāo)準(zhǔn)DNA斷裂劑，發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞凝膠電泳法可以用于檢測DNA-DNA交聯(lián)，但其敏感性不高；Merk等[8]用γ射線作為DNA交聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑，結(jié)果顯示該法檢測DNA蛋白交聯(lián)較敏感，而不適合于DNA-DNA交聯(lián)的檢測。
, 百拇醫(yī)藥
單細(xì)胞凝膠電泳法檢測過氧化氫所致的DNA鏈斷裂非常敏感[9]。在我們剛完成的研究中發(fā)現(xiàn)，1℃時過氧化氫與DNA的鏈斷裂仍存在劑量效應(yīng)關(guān)系[10]，在此條件下，既可抑制DNA的修復(fù)功能，又可使過氧化氫起到DNA標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑的作用；同時，考慮到過氧化氫極易得到，所以本研究將在1℃條件下把它作為DNA的標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑用以檢測DNA-DNA交鏈。
順鉑(Cisplatin,DDP)是一種導(dǎo)致以DNA-DNA鏈內(nèi)交聯(lián)為主的抗腫瘤藥[1]，而絲裂酶素C(Mitomycin C,MMC)則主要導(dǎo)致DNA-DNA鏈間交聯(lián)[2]，本研究將以此兩藥物作為DNA-DNA交聯(lián)物的陽性標(biāo)準(zhǔn)。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器 正常及低熔點(diǎn)瓊脂凝膠(Promega)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、DDP(昆明三戍貴金屬藥業(yè)公司)、MMC(Kyowa Hakko Kogyo)、水平電泳槽、中壓電泳儀(Bio RAD)、熒光顯微鏡及計算機(jī)成像與分析系統(tǒng)(ZEISS)。
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1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒 猴腎Vero細(xì)胞株由香港大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈。將3×105個細(xì)胞接種于25?cm2培養(yǎng)瓶，每種毒物6瓶，常規(guī)培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)為15%的小牛血清及100?U/ml的青霉素和鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳，37 ℃，至細(xì)胞長成80%～90%融合度時(約24?h)，分別用不同濃度的DDP和MMC染毒2?h，質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA和質(zhì)量濃度為0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加5?ml預(yù)冷完全培養(yǎng)液中和消化液，吸入離心管，4?℃1 000?r/min，離心5?min，去上清，加預(yù)冷無菌PBS2?ml，制成細(xì)胞懸液。
1.3 過氧化氫處理 將上述每個劑量組的細(xì)胞懸液分成兩份：A份1?ml,B份0.9?ml，后者再加0.1?ml 5?mmol的過氧化氫，混勻，全部冰浴1?h。
1.4 應(yīng)用細(xì)胞液制備 4 ℃，1 000?r/min離心5?min，去上清，每管加150?μl PBS,懸浮細(xì)胞。
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1.5 單細(xì)胞凝膠電泳 參照莊志雄等[10，11]的方法，每個劑量組制備4片凝膠：有過氧化氫染毒者和無其染毒者各制兩片。每片膠抓取25個細(xì)胞，即每種處理樣品抓取50個細(xì)胞。3次重復(fù)實驗，則每種處理樣品抓取150個細(xì)胞。
1.6 細(xì)胞存活率計數(shù) 采用常規(guī)臺盼藍(lán)細(xì)胞存活率計數(shù)法，計數(shù)200個細(xì)胞。
1.7 圖象分析和數(shù)據(jù)處理 用KS 400 3.0逐個細(xì)胞分析，再將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入SPSS 8.0處理，進(jìn)行卡方檢驗、方差分析和Pearson相關(guān)系數(shù)計算與檢驗。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞存活率 第1次實驗時，對冰浴作用后各組的細(xì)胞存活率經(jīng)臺盼藍(lán)計數(shù)，結(jié)果表明：各組細(xì)胞存活率均在96%以上，經(jīng)卡方檢驗，各劑量組間及是否有過氧化氫作用組間的細(xì)胞存活率差異均無顯著性。
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2.2 無過氧化氫作用的SCGE結(jié)果 3次重復(fù)實驗結(jié)果均顯示，無過氧化氫作用時，DDP和MMC的低劑量組(包括0劑量組)在鏡下都只見到完整的細(xì)胞核，當(dāng)DDP的濃度為500?μmol和1 000?μmol時，MMC濃度為500?μmol時，可見有輕微的拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)(具體數(shù)據(jù)未列出)。
2.3 過氧化氫作用后SCGE結(jié)果 從表1可見，有關(guān)尾部的4個指標(biāo)對DDP和MMC都得到了一致的結(jié)果。對DDP，其濃度為20?μmol時，對過氧化氫所致的細(xì)胞拖尾尚無顯著影響，從50?μmol開始，各高劑量組的該4個指標(biāo)的值均顯著縮小，但100?μmol組和500?μmol組之間差異無顯著性，至最大劑量組(1 000?μmol)時，肉眼已見不到明顯的尾部；對MMC，其濃度為5?μmol時，各指標(biāo)值無顯著變化，10?μmol時即顯著縮小各指標(biāo)的值，隨濃度的增高，影響越大，并且每組間的差異均有顯著性，至最大劑量組時，同樣見不到尾部。
表1 DDP和MMC對過氧化氫致DNA鏈斷裂的影響(
+s) 組別
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濃度
(μmol/L)
尾面積(×103)
尾積分(×103)
尾長(×102)
尾矩(×108)
Cis-Platin
0
23.13±18.09
2.39±1.16
1.90±0.71
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2.67±1.99
(DDP)
1
20.79±11.43
2.48±0.70
1.89±0.56
2.72±1.16
2
14.75±12.57ab
2.00±0.85ab
1.26±0.72ab
, 百拇醫(yī)藥
2.14±1.43ab
3
7.99±7.76abc
1.53±0.70abc
0.92±0.58abc
1.45±1.08abc
4
7.46±6.22abc
1.50±0.59abc
0.90±0.55abc
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1.32±0.76abc
5
2.09±1.65abcde
0.55±0.33abcde
0.32±0.19abcde
0.26±0.20abcde
Mitomycin C
(MMC)
0
30.56±20.12
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5.34±2.68
3.09±1.87
5.66±2.85
1
29.23±18.67
4.59±2.03
3.15±2.06
5.32±2.78
2
21.34±10.45ab
2.56±1.16ab
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2.12±1.20ab
3.29±2.54ab
3
12.83±5.78abc
1.83±0.87abc
1.15±0.76abc
2.5±1.72abc
4
6.79±5.65abcd
1.01±0.54abcd
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0.79±0.38abcd
1.17±0.57abcd
5
1.27±1.01abcde
0.33±0.28abcde
0.25±0.14abcde
0.31±0.29abcde
0，1，2，3，4，5分別代表DDP濃度為0、20、50、100、500、1 000(μmol/L)和MMC濃度為0，5，10，50，100，500(μmol/L)；a：與0組比較P<0.01；b:1組比較P<0.01；c:與2組比較P<0.01；d:與3組比較P<0.01；e:與4組比較P<0.01。3次重復(fù)實驗，各劑量組共計數(shù)150個細(xì)胞。 經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)的計算和顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)該兩種藥物的4個指標(biāo)與其濃度都呈顯著的負(fù)線性相關(guān)，MMC較DDP的相關(guān)系數(shù)大，見表2。
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表2 DDP和MMC濃度與各指標(biāo)間的Pearson相關(guān)系數(shù) 組別
尾面積
尾積分
尾長
尾矩
DDP
-0.468
-0.597
-0.587
-0.525
MMC
-0.769
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-0.756
-0.682
-0.797
所有相關(guān)系數(shù)均經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，其相關(guān)性都具有非常顯著性
(P<0.01)
3 討論
單細(xì)胞凝膠電泳法檢測DNA交聯(lián)，必須利用某種DNA鏈斷裂劑。這種斷裂劑除具有穩(wěn)定的導(dǎo)致DNA鏈斷裂效應(yīng)外，還不能影響受檢細(xì)胞原有的其他特性(特別是不能有致交聯(lián)功能)；為把該方法應(yīng)用到實際工作中，作用的時間應(yīng)是在受檢物染毒之后；另外，由于完整細(xì)胞對其DNA的損傷具有很強(qiáng)的即時修復(fù)能力[12]，所以，這種斷裂劑的作用條件必須是盡量減少其DNA修復(fù)的。從現(xiàn)有的這方面的少量文獻(xiàn)來看，都采用MMS和γ射線作為這種DNA斷裂劑[7，8]。Merk等[8]在交聯(lián)劑作用V79細(xì)胞后，在冰浴條件下用γ線照射以抑制DNA的修復(fù)。考慮到過氧化氫是一種確認(rèn)的單純的DNA斷裂劑[9]，應(yīng)同樣可起到MMS和γ射線的作用，并且過氧化氫廉價，一般實驗室都極易得到，故我們試圖將其用于這一研究。在我們的前期實驗中[10]，發(fā)現(xiàn)過氧化氫在冰浴條件下，盡管與37 ℃條件比較，其相同劑量的DNA損傷程度明顯變輕，但與DNA鏈斷裂之間仍存在劑量效應(yīng)關(guān)系，故它在冰浴條件下抑制DNA修復(fù)的同時，同樣可以作為穩(wěn)定的DNA鏈斷裂劑，我們并得到了其適宜劑量是500μmol。本次的研究結(jié)果進(jìn)一步表明了過氧化氫在冰浴條件下可以起到與MMS和γ射線相同的作用。
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與堿洗脫法檢測DNA-DNA交聯(lián)相比，單細(xì)胞凝膠電泳法具有敏感、快速、簡便和廉價等優(yōu)點(diǎn)，況且不涉及同位素，需要的細(xì)胞量少，并可檢測到單個細(xì)胞水平的DNA損傷。Zwelling等[13]用堿洗脫法在V79細(xì)胞能檢測到DDP致顯著DNA-DNA交聯(lián)的最小劑量是10?μmol，而Hincks等[14]用該法在人上皮細(xì)胞能檢測到MMC致顯著DNA-DNA交聯(lián)的相應(yīng)劑量是20?μmol。我們經(jīng)過多次預(yù)實驗得到了用此法檢測DDP和MMC致DNA-DNA交聯(lián)的具有劑量效應(yīng)關(guān)系的最小和最大劑量，DDP是50～1 000?μmol，MMC是10～500?μmol。可見，本方法檢測DDP不如堿洗脫法敏感，但檢測MMC的敏感性要高于后者。
Pfuhler等[7]用MMS在人白細(xì)胞所得到的可見顯著DNA-DNA交聯(lián)的最小劑量對DDP和MMC分別是330?μmol和200?μmol，Merk等[8]用γ射線在V79細(xì)胞所得到的相應(yīng)結(jié)果則分別是100?μmol和10?μmol。由此可見，我們的實驗方法檢測DNA-DNA交聯(lián)的敏感性遠(yuǎn)高于Pfuhler等的，而與Merk等的相近，況且對DDP，本法似乎比Merk等的更敏感。
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總之，本研究為利用SCGE檢測DNA-DNA交聯(lián)探索出了一條迄今為止更敏感、更廉價和簡便的途徑。
本課題受國家自然科學(xué)基金(39970636)和深圳市科技計劃項目資助
參考文獻(xiàn)
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(收稿日期：2000-04-19), 百拇醫(yī)藥
單位：肖勇梅(中山醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)；任澤舫 莊志雄 張綿周 黃海雄 張丙堯(中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院深圳研究中心，518020)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000427 DNA交聯(lián)是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的嚴(yán)重事件，它影響DNA的正常復(fù)制功能，從而導(dǎo)致突變或腫瘤。多種致癌物質(zhì)和抗腫瘤藥物可引起DNA-DNA交聯(lián)，如砷、鎳、鉻、順鉑、絲裂酶素C等[1～4]。因此，檢測外環(huán)境因素所導(dǎo)致的DNA-DNA交聯(lián)是判斷其是否為誘變劑或致癌因素的有效手段。傳統(tǒng)檢測DNA交聯(lián)物的方法是堿洗脫法，但該法昂貴、耗時、操作復(fù)雜，并涉及到同位素[5]。發(fā)展新的DNA-DNA交聯(lián)物檢測方法實有必要。
單細(xì)胞凝膠電泳法是一種公認(rèn)的檢測DNA鏈斷裂的敏感、快速、簡便和廉價的方法[6]。在此基礎(chǔ)上，多位學(xué)者對其進(jìn)行了改良[7，8]，試圖將該法用于DNA交聯(lián)物的檢測。其改良的原理是在交聯(lián)劑作用細(xì)胞時用DNA斷裂劑作用，這樣，交聯(lián)劑就會減少后者所致的DNA斷裂后電泳的距離和量，與未加交聯(lián)劑相比，慧星尾部減少的長度等指標(biāo)與交聯(lián)物的量成正比。這些研究常用的DNA斷裂劑是甲基甲磺酸(MMS)和γ射線。Pfuhler等[7]采用MMS作為標(biāo)準(zhǔn)DNA斷裂劑，發(fā)現(xiàn)單細(xì)胞凝膠電泳法可以用于檢測DNA-DNA交聯(lián)，但其敏感性不高；Merk等[8]用γ射線作為DNA交聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑，結(jié)果顯示該法檢測DNA蛋白交聯(lián)較敏感，而不適合于DNA-DNA交聯(lián)的檢測。
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單細(xì)胞凝膠電泳法檢測過氧化氫所致的DNA鏈斷裂非常敏感[9]。在我們剛完成的研究中發(fā)現(xiàn)，1℃時過氧化氫與DNA的鏈斷裂仍存在劑量效應(yīng)關(guān)系[10]，在此條件下，既可抑制DNA的修復(fù)功能，又可使過氧化氫起到DNA標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑的作用；同時，考慮到過氧化氫極易得到，所以本研究將在1℃條件下把它作為DNA的標(biāo)準(zhǔn)斷裂劑用以檢測DNA-DNA交鏈。
順鉑(Cisplatin,DDP)是一種導(dǎo)致以DNA-DNA鏈內(nèi)交聯(lián)為主的抗腫瘤藥[1]，而絲裂酶素C(Mitomycin C,MMC)則主要導(dǎo)致DNA-DNA鏈間交聯(lián)[2]，本研究將以此兩藥物作為DNA-DNA交聯(lián)物的陽性標(biāo)準(zhǔn)。
1 材料與方法
1.1 試劑與儀器 正常及低熔點(diǎn)瓊脂凝膠(Promega)、DMEM培養(yǎng)基(Gibco)、DDP(昆明三戍貴金屬藥業(yè)公司)、MMC(Kyowa Hakko Kogyo)、水平電泳槽、中壓電泳儀(Bio RAD)、熒光顯微鏡及計算機(jī)成像與分析系統(tǒng)(ZEISS)。
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1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與染毒 猴腎Vero細(xì)胞株由香港大學(xué)微生物學(xué)教研室惠贈。將3×105個細(xì)胞接種于25?cm2培養(yǎng)瓶，每種毒物6瓶，常規(guī)培養(yǎng)：DMEM培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)為15%的小牛血清及100?U/ml的青霉素和鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳，37 ℃，至細(xì)胞長成80%～90%融合度時(約24?h)，分別用不同濃度的DDP和MMC染毒2?h，質(zhì)量濃度為0.02%的EDTA和質(zhì)量濃度為0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加5?ml預(yù)冷完全培養(yǎng)液中和消化液，吸入離心管，4?℃1 000?r/min，離心5?min，去上清，加預(yù)冷無菌PBS2?ml，制成細(xì)胞懸液。
1.3 過氧化氫處理 將上述每個劑量組的細(xì)胞懸液分成兩份：A份1?ml,B份0.9?ml，后者再加0.1?ml 5?mmol的過氧化氫，混勻，全部冰浴1?h。
1.4 應(yīng)用細(xì)胞液制備 4 ℃，1 000?r/min離心5?min，去上清，每管加150?μl PBS,懸浮細(xì)胞。
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1.5 單細(xì)胞凝膠電泳 參照莊志雄等[10，11]的方法，每個劑量組制備4片凝膠：有過氧化氫染毒者和無其染毒者各制兩片。每片膠抓取25個細(xì)胞，即每種處理樣品抓取50個細(xì)胞。3次重復(fù)實驗，則每種處理樣品抓取150個細(xì)胞。
1.6 細(xì)胞存活率計數(shù) 采用常規(guī)臺盼藍(lán)細(xì)胞存活率計數(shù)法，計數(shù)200個細(xì)胞。
1.7 圖象分析和數(shù)據(jù)處理 用KS 400 3.0逐個細(xì)胞分析，再將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)入SPSS 8.0處理，進(jìn)行卡方檢驗、方差分析和Pearson相關(guān)系數(shù)計算與檢驗。
2 結(jié)果
2.1 細(xì)胞存活率 第1次實驗時，對冰浴作用后各組的細(xì)胞存活率經(jīng)臺盼藍(lán)計數(shù)，結(jié)果表明：各組細(xì)胞存活率均在96%以上，經(jīng)卡方檢驗，各劑量組間及是否有過氧化氫作用組間的細(xì)胞存活率差異均無顯著性。
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2.2 無過氧化氫作用的SCGE結(jié)果 3次重復(fù)實驗結(jié)果均顯示，無過氧化氫作用時，DDP和MMC的低劑量組(包括0劑量組)在鏡下都只見到完整的細(xì)胞核，當(dāng)DDP的濃度為500?μmol和1 000?μmol時，MMC濃度為500?μmol時，可見有輕微的拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)(具體數(shù)據(jù)未列出)。
2.3 過氧化氫作用后SCGE結(jié)果 從表1可見，有關(guān)尾部的4個指標(biāo)對DDP和MMC都得到了一致的結(jié)果。對DDP，其濃度為20?μmol時，對過氧化氫所致的細(xì)胞拖尾尚無顯著影響，從50?μmol開始，各高劑量組的該4個指標(biāo)的值均顯著縮小，但100?μmol組和500?μmol組之間差異無顯著性，至最大劑量組(1 000?μmol)時，肉眼已見不到明顯的尾部；對MMC，其濃度為5?μmol時，各指標(biāo)值無顯著變化，10?μmol時即顯著縮小各指標(biāo)的值，隨濃度的增高，影響越大，并且每組間的差異均有顯著性，至最大劑量組時，同樣見不到尾部。
表1 DDP和MMC對過氧化氫致DNA鏈斷裂的影響(
+s) 組別, http://www.www.srpcoatings.com
濃度
(μmol/L)
尾面積(×103)
尾積分(×103)
尾長(×102)
尾矩(×108)
Cis-Platin
0
23.13±18.09
2.39±1.16
1.90±0.71
, 百拇醫(yī)藥
2.67±1.99
(DDP)
1
20.79±11.43
2.48±0.70
1.89±0.56
2.72±1.16
2
14.75±12.57ab
2.00±0.85ab
1.26±0.72ab
, 百拇醫(yī)藥
2.14±1.43ab
3
7.99±7.76abc
1.53±0.70abc
0.92±0.58abc
1.45±1.08abc
4
7.46±6.22abc
1.50±0.59abc
0.90±0.55abc
, 百拇醫(yī)藥
1.32±0.76abc
5
2.09±1.65abcde
0.55±0.33abcde
0.32±0.19abcde
0.26±0.20abcde
Mitomycin C
(MMC)
0
30.56±20.12
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5.34±2.68
3.09±1.87
5.66±2.85
1
29.23±18.67
4.59±2.03
3.15±2.06
5.32±2.78
2
21.34±10.45ab
2.56±1.16ab
, 百拇醫(yī)藥
2.12±1.20ab
3.29±2.54ab
3
12.83±5.78abc
1.83±0.87abc
1.15±0.76abc
2.5±1.72abc
4
6.79±5.65abcd
1.01±0.54abcd
, 百拇醫(yī)藥
0.79±0.38abcd
1.17±0.57abcd
5
1.27±1.01abcde
0.33±0.28abcde
0.25±0.14abcde
0.31±0.29abcde
0，1，2，3，4，5分別代表DDP濃度為0、20、50、100、500、1 000(μmol/L)和MMC濃度為0，5，10，50，100，500(μmol/L)；a：與0組比較P<0.01；b:1組比較P<0.01；c:與2組比較P<0.01；d:與3組比較P<0.01；e:與4組比較P<0.01。3次重復(fù)實驗，各劑量組共計數(shù)150個細(xì)胞。 經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)的計算和顯著性檢驗，發(fā)現(xiàn)該兩種藥物的4個指標(biāo)與其濃度都呈顯著的負(fù)線性相關(guān)，MMC較DDP的相關(guān)系數(shù)大，見表2。
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表2 DDP和MMC濃度與各指標(biāo)間的Pearson相關(guān)系數(shù) 組別
尾面積
尾積分
尾長
尾矩
DDP
-0.468
-0.597
-0.587
-0.525
MMC
-0.769
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-0.756
-0.682
-0.797
所有相關(guān)系數(shù)均經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，其相關(guān)性都具有非常顯著性
(P<0.01)
3 討論
單細(xì)胞凝膠電泳法檢測DNA交聯(lián)，必須利用某種DNA鏈斷裂劑。這種斷裂劑除具有穩(wěn)定的導(dǎo)致DNA鏈斷裂效應(yīng)外，還不能影響受檢細(xì)胞原有的其他特性(特別是不能有致交聯(lián)功能)；為把該方法應(yīng)用到實際工作中，作用的時間應(yīng)是在受檢物染毒之后；另外，由于完整細(xì)胞對其DNA的損傷具有很強(qiáng)的即時修復(fù)能力[12]，所以，這種斷裂劑的作用條件必須是盡量減少其DNA修復(fù)的。從現(xiàn)有的這方面的少量文獻(xiàn)來看，都采用MMS和γ射線作為這種DNA斷裂劑[7，8]。Merk等[8]在交聯(lián)劑作用V79細(xì)胞后，在冰浴條件下用γ線照射以抑制DNA的修復(fù)。考慮到過氧化氫是一種確認(rèn)的單純的DNA斷裂劑[9]，應(yīng)同樣可起到MMS和γ射線的作用，并且過氧化氫廉價，一般實驗室都極易得到，故我們試圖將其用于這一研究。在我們的前期實驗中[10]，發(fā)現(xiàn)過氧化氫在冰浴條件下，盡管與37 ℃條件比較，其相同劑量的DNA損傷程度明顯變輕，但與DNA鏈斷裂之間仍存在劑量效應(yīng)關(guān)系，故它在冰浴條件下抑制DNA修復(fù)的同時，同樣可以作為穩(wěn)定的DNA鏈斷裂劑，我們并得到了其適宜劑量是500μmol。本次的研究結(jié)果進(jìn)一步表明了過氧化氫在冰浴條件下可以起到與MMS和γ射線相同的作用。
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與堿洗脫法檢測DNA-DNA交聯(lián)相比，單細(xì)胞凝膠電泳法具有敏感、快速、簡便和廉價等優(yōu)點(diǎn)，況且不涉及同位素，需要的細(xì)胞量少，并可檢測到單個細(xì)胞水平的DNA損傷。Zwelling等[13]用堿洗脫法在V79細(xì)胞能檢測到DDP致顯著DNA-DNA交聯(lián)的最小劑量是10?μmol，而Hincks等[14]用該法在人上皮細(xì)胞能檢測到MMC致顯著DNA-DNA交聯(lián)的相應(yīng)劑量是20?μmol。我們經(jīng)過多次預(yù)實驗得到了用此法檢測DDP和MMC致DNA-DNA交聯(lián)的具有劑量效應(yīng)關(guān)系的最小和最大劑量，DDP是50～1 000?μmol，MMC是10～500?μmol。可見，本方法檢測DDP不如堿洗脫法敏感，但檢測MMC的敏感性要高于后者。
Pfuhler等[7]用MMS在人白細(xì)胞所得到的可見顯著DNA-DNA交聯(lián)的最小劑量對DDP和MMC分別是330?μmol和200?μmol，Merk等[8]用γ射線在V79細(xì)胞所得到的相應(yīng)結(jié)果則分別是100?μmol和10?μmol。由此可見，我們的實驗方法檢測DNA-DNA交聯(lián)的敏感性遠(yuǎn)高于Pfuhler等的，而與Merk等的相近，況且對DDP，本法似乎比Merk等的更敏感。
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總之，本研究為利用SCGE檢測DNA-DNA交聯(lián)探索出了一條迄今為止更敏感、更廉價和簡便的途徑。
本課題受國家自然科學(xué)基金(39970636)和深圳市科技計劃項目資助
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(收稿日期：2000-04-19), 百拇醫(yī)藥