反相離子對(duì)色譜法測(cè)定馬來(lái)酸噻嗎洛爾及其滴眼液中有關(guān)物質(zhì)
作者:霍秀敏
單位:霍秀敏(天津市藥品檢驗(yàn)所 300070)
關(guān)鍵詞:反相離子對(duì)高效液相色譜法;有關(guān)物質(zhì);馬來(lái)酸噻嗎洛爾;馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液
藥物分析雜志000316 摘要 目的:建立用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定馬來(lái)酸噻嗎洛爾及其滴眼液中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法:采用國(guó)產(chǎn)YWG-C18柱,0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液-乙腈(70∶30)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)297 nm。結(jié)果:該方法在3.0~11.2 μg.mL-1范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 3)。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,優(yōu)于薄層法。
Determination of Related Substances in Timolol Maleate and
, 百拇醫(yī)藥
its Eye Drops by Reversed Phase Ion-pair HPLC
Huo Xiumin
(Tianjin Institute for Drug Control,300070)
Abstract Objective:A reversed phase ion-pair HPLC method was developed of the determination of related substances in timolol maleate and its eye drops.Methods:The analysis was carried on an ODS column.The mobile phase consisted of 0.065% sodium octylsulphonate phosphate buffer-acetonitrile(70∶30).Detection was at 297 nm.Result:The good linearity was obtained between peak area and concentration ranging from 3.0~11.2 μg.mL-1(r=0.999 3).Conclusion:The method was proved to be simple,rapid,and accurate.And better than thin layer chromatography method.
, 百拇醫(yī)藥
Key words reversed phase ion-pair HPLC,related substances,timolol maleate,timolol maleate eye drops
馬來(lái)酸噻嗎洛爾是一種非選擇性β-腎上腺能阻滯劑,有明顯降低眼內(nèi)壓的作用,其滴眼液治療原發(fā)性開(kāi)角型青光眼及無(wú)晶狀體青光眼在臨床上得到廣泛應(yīng)用。中國(guó)藥典1995年版收載了原料藥及其滴眼液[1],USP Ⅹ 也有收載[2],均采用薄層層析法,其有關(guān)物質(zhì)的檢查,BP 1993[3]是采用高效液相色譜法,但使用國(guó)產(chǎn)C18柱按其色譜條件不能得到理想的色譜圖,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)多種色譜條件的篩選,采用反相離子對(duì)高效液相色譜法,可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行樣品測(cè)定。
1 儀器、藥品與試劑
島津LC-10AD泵,SPD-10A紫外檢測(cè)器,CTO-10A柱溫箱,C-R6A數(shù)據(jù)處理機(jī)。
, http://www.www.srpcoatings.com
馬來(lái)酸噻嗎洛爾(天津中央制藥廠),馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液(天津市售產(chǎn)品),輔料及中間產(chǎn)物(天津中央制藥廠)。
乙腈(色譜純),磷酸二氫鈉(化學(xué)純),辛烷磺酸鈉(山東禹王實(shí)業(yè)總公司化學(xué)試劑廠)。
2 色譜條件
色譜柱:YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液[取磷酸二氫鈉1.56 g,加水1000 mL,用磷酸(1→10)調(diào)節(jié)pH至3.50±0.05,加入辛烷磺酸鈉0.65 g使溶解,搖勻]-乙腈(70∶30);流速:0.7 mL.min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):297 nm;積分儀衰減:0;紙速:1.5 mm.min-1;靈敏度:0.05 AUFS;柱溫:40 ℃,理論板數(shù)不低于2 000。
, 百拇醫(yī)藥
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1 色譜條件的選擇 經(jīng)過(guò)對(duì)不同磷酸鹽、不同濃度(0.02,0.01,0.005 mol.L-1)緩沖溶液與甲醇或乙腈以不同配比(65∶35,70∶30,75∶25)篩選,并對(duì)加入不同離子對(duì)試劑(己烷磺酸鈉及辛烷磺酸鈉),比較其不同濃度(0.085%,0.065%,0.045%),不同pH條件(pH=3.0,pH=3.5)。最終選擇0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉緩沖液[用磷酸(1→10)調(diào)pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸鈉溶液與乙腈(70∶30)組成的流動(dòng)相為最佳條件(圖1)。另以流動(dòng)相溶解原料作紫外掃描,最大吸收297 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
圖1 原料藥(A)及滴眼液(B)色譜圖
, 百拇醫(yī)藥 1.馬來(lái)酸 2,3.雜質(zhì)峰 4.噻嗎洛爾
3.2 線性實(shí)驗(yàn) 精密取馬來(lái)酸噻嗎洛爾適量(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg)置200 mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。分別精密取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,進(jìn)樣20 μL,以濃度(μg.mL-1)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),得到噻嗎洛爾的回歸方程:
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
結(jié)果表明濃度在3.0~11.2 μg.mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。
3.3 有關(guān)影響因素實(shí)驗(yàn) 取生產(chǎn)廠提供的馬來(lái)酸噻嗎洛爾中間體噻二唑、
唑烷進(jìn)行實(shí)驗(yàn),均對(duì)主峰無(wú)影響(圖2)。另按滴眼液處方配制空白輔料溶液,在規(guī)定的色譜條件下,基本為一直線,對(duì)本實(shí)驗(yàn)也無(wú)干擾。
, http://www.www.srpcoatings.com
圖2 中間體圖譜
A.噻二唑 B.
唑烷
3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取馬來(lái)酸噻嗎洛爾(980102批)適量(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg),置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,重復(fù)進(jìn)樣6次,噻嗎洛爾RSD=0.35%,馬來(lái)酸RSD=0.44%,有較好的精密度。
3.5 加速實(shí)驗(yàn) 將原料藥980102批及滴眼液980502光照27 d后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。原料藥經(jīng)光照后比較穩(wěn)定,色譜圖無(wú)變化,滴眼液色譜圖有明顯改變(圖3),雜質(zhì)峰增多,含量下降。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,該方法能夠反映出樣品的變化,可以控制產(chǎn)品質(zhì)量。
表1 光照對(duì)樣品的影響(n=3) 樣 品
, http://www.www.srpcoatings.com 初始含量/%
光照后含量/%
結(jié)論
原料藥
99.2
99.2
穩(wěn)定
滴眼液
98.8
86.6
不穩(wěn)定(雜質(zhì)峰增多)
圖3 光照27 d色譜圖
, http://www.www.srpcoatings.com
A.原料藥 B.滴眼液
3.6 本法與TLC法的比較 按照中國(guó)藥典1995年版馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥有關(guān)物質(zhì)TLC法對(duì)2批原料及滴眼液(980502批),光照7 d及27 d的樣品進(jìn)行測(cè)定,與本方法比較結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明HPLC法比TLC法分析靈敏度高且能準(zhǔn)確定量,TLC法檢出的雜斑數(shù)較少且不容易判斷結(jié)果。
表2 HPLC法與TLC法檢查有關(guān)物質(zhì)的比較 樣品
批號(hào)
HPLC法
(雜峰數(shù))
TLC法
(雜斑數(shù))
原料藥
, 百拇醫(yī)藥
960302
960401
1
1
未檢出
未檢出
滴眼液
980502
(光照7 d)
(光照27 d)
4
8
1
, 百拇醫(yī)藥
3
4 樣品測(cè)定
4.1 原料藥 取本品(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg),精密稱(chēng)定,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度,作為供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL,置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分色譜峰高約為記錄儀滿(mǎn)量程的10%~20%,再取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍(主成分保留時(shí)間應(yīng)在10 min后),除馬來(lái)酸峰之外,供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰,量取各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液的峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL(約相當(dāng)于噻嗎洛爾5 mg)置10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度作為對(duì)照溶液,照上述方法檢查,應(yīng)符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表3。
, 百拇醫(yī)藥
表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 樣品
批號(hào)
對(duì)照峰面積(n=3)
雜質(zhì)峰面積之和
雜質(zhì)量/%
原
料
藥
960401
960402
910302
910401
980102
, 百拇醫(yī)藥
5082
5332
5120
5120
4584
—
—
24
24
—
—
—
0.004
, 百拇醫(yī)藥 0.004
—
滴
眼
液
970601
980501
980502
980306
980504
5146
4807
4862
, http://www.www.srpcoatings.com
5554
5014
3092
1672
1922
1422
1560
0.60
0.35
0.40
0.26
0.31
5 討論
, 百拇醫(yī)藥
5.1 實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相比例的調(diào)整,以主峰保留時(shí)間在10 min之后為宜,馬來(lái)酸峰與相鄰雜質(zhì)峰基線分離較好。
5.2 方法中規(guī)定記錄色譜圖為主峰保留時(shí)間的3倍,是由于原料藥中間體噻二唑的保留時(shí)間約為26 min,實(shí)驗(yàn)中970601批滴眼液中檢出該雜峰。
5.3 本實(shí)驗(yàn)供試液自然放置24 h后復(fù)測(cè),溶液濃度不變,雜質(zhì)量不增加,比較穩(wěn)定。
參考文獻(xiàn)
1,中國(guó)藥典.1995.二部:46
2,USP.ⅩⅩⅢ.1553
3,BP.1993.1132
(本文于1999年4月16日收到), 百拇醫(yī)藥
單位:霍秀敏(天津市藥品檢驗(yàn)所 300070)
關(guān)鍵詞:反相離子對(duì)高效液相色譜法;有關(guān)物質(zhì);馬來(lái)酸噻嗎洛爾;馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液
藥物分析雜志000316 摘要 目的:建立用反相離子對(duì)色譜法測(cè)定馬來(lái)酸噻嗎洛爾及其滴眼液中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法:采用國(guó)產(chǎn)YWG-C18柱,0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液-乙腈(70∶30)為流動(dòng)相,檢測(cè)波長(zhǎng)297 nm。結(jié)果:該方法在3.0~11.2 μg.mL-1范圍內(nèi),峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 3)。結(jié)論:該方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確,優(yōu)于薄層法。
Determination of Related Substances in Timolol Maleate and
, 百拇醫(yī)藥
its Eye Drops by Reversed Phase Ion-pair HPLC
Huo Xiumin
(Tianjin Institute for Drug Control,300070)
Abstract Objective:A reversed phase ion-pair HPLC method was developed of the determination of related substances in timolol maleate and its eye drops.Methods:The analysis was carried on an ODS column.The mobile phase consisted of 0.065% sodium octylsulphonate phosphate buffer-acetonitrile(70∶30).Detection was at 297 nm.Result:The good linearity was obtained between peak area and concentration ranging from 3.0~11.2 μg.mL-1(r=0.999 3).Conclusion:The method was proved to be simple,rapid,and accurate.And better than thin layer chromatography method.
, 百拇醫(yī)藥
Key words reversed phase ion-pair HPLC,related substances,timolol maleate,timolol maleate eye drops
馬來(lái)酸噻嗎洛爾是一種非選擇性β-腎上腺能阻滯劑,有明顯降低眼內(nèi)壓的作用,其滴眼液治療原發(fā)性開(kāi)角型青光眼及無(wú)晶狀體青光眼在臨床上得到廣泛應(yīng)用。中國(guó)藥典1995年版收載了原料藥及其滴眼液[1],USP Ⅹ 也有收載[2],均采用薄層層析法,其有關(guān)物質(zhì)的檢查,BP 1993[3]是采用高效液相色譜法,但使用國(guó)產(chǎn)C18柱按其色譜條件不能得到理想的色譜圖,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)對(duì)多種色譜條件的篩選,采用反相離子對(duì)高效液相色譜法,可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行樣品測(cè)定。
1 儀器、藥品與試劑
島津LC-10AD泵,SPD-10A紫外檢測(cè)器,CTO-10A柱溫箱,C-R6A數(shù)據(jù)處理機(jī)。
, http://www.www.srpcoatings.com
馬來(lái)酸噻嗎洛爾(天津中央制藥廠),馬來(lái)酸噻嗎洛爾滴眼液(天津市售產(chǎn)品),輔料及中間產(chǎn)物(天津中央制藥廠)。
乙腈(色譜純),磷酸二氫鈉(化學(xué)純),辛烷磺酸鈉(山東禹王實(shí)業(yè)總公司化學(xué)試劑廠)。
2 色譜條件
色譜柱:YWG-C18(10 μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相:0.065%辛烷磺酸鈉磷酸鹽緩沖液[取磷酸二氫鈉1.56 g,加水1000 mL,用磷酸(1→10)調(diào)節(jié)pH至3.50±0.05,加入辛烷磺酸鈉0.65 g使溶解,搖勻]-乙腈(70∶30);流速:0.7 mL.min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):297 nm;積分儀衰減:0;紙速:1.5 mm.min-1;靈敏度:0.05 AUFS;柱溫:40 ℃,理論板數(shù)不低于2 000。
, 百拇醫(yī)藥
3 實(shí)驗(yàn)方法
3.1 色譜條件的選擇 經(jīng)過(guò)對(duì)不同磷酸鹽、不同濃度(0.02,0.01,0.005 mol.L-1)緩沖溶液與甲醇或乙腈以不同配比(65∶35,70∶30,75∶25)篩選,并對(duì)加入不同離子對(duì)試劑(己烷磺酸鈉及辛烷磺酸鈉),比較其不同濃度(0.085%,0.065%,0.045%),不同pH條件(pH=3.0,pH=3.5)。最終選擇0.01 mol.L-1磷酸二氫鈉緩沖液[用磷酸(1→10)調(diào)pH=3.5]配制的0.065%辛烷磺酸鈉溶液與乙腈(70∶30)組成的流動(dòng)相為最佳條件(圖1)。另以流動(dòng)相溶解原料作紫外掃描,最大吸收297 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。
圖1 原料藥(A)及滴眼液(B)色譜圖
, 百拇醫(yī)藥 1.馬來(lái)酸 2,3.雜質(zhì)峰 4.噻嗎洛爾
3.2 線性實(shí)驗(yàn) 精密取馬來(lái)酸噻嗎洛爾適量(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg)置200 mL量瓶中,加流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度。分別精密取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,進(jìn)樣20 μL,以濃度(μg.mL-1)為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo),得到噻嗎洛爾的回歸方程:
Y=875.19X-137.05 r=0.999 3
結(jié)果表明濃度在3.0~11.2 μg.mL-1范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。
3.3 有關(guān)影響因素實(shí)驗(yàn) 取生產(chǎn)廠提供的馬來(lái)酸噻嗎洛爾中間體噻二唑、
, http://www.www.srpcoatings.com
圖2 中間體圖譜
A.噻二唑 B.
3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取馬來(lái)酸噻嗎洛爾(980102批)適量(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg),置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻,重復(fù)進(jìn)樣6次,噻嗎洛爾RSD=0.35%,馬來(lái)酸RSD=0.44%,有較好的精密度。
3.5 加速實(shí)驗(yàn) 將原料藥980102批及滴眼液980502光照27 d后,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。原料藥經(jīng)光照后比較穩(wěn)定,色譜圖無(wú)變化,滴眼液色譜圖有明顯改變(圖3),雜質(zhì)峰增多,含量下降。本實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,該方法能夠反映出樣品的變化,可以控制產(chǎn)品質(zhì)量。
表1 光照對(duì)樣品的影響(n=3) 樣 品
, http://www.www.srpcoatings.com 初始含量/%
光照后含量/%
結(jié)論
原料藥
99.2
99.2
穩(wěn)定
滴眼液
98.8
86.6
不穩(wěn)定(雜質(zhì)峰增多)
圖3 光照27 d色譜圖
, http://www.www.srpcoatings.com
A.原料藥 B.滴眼液
3.6 本法與TLC法的比較 按照中國(guó)藥典1995年版馬來(lái)酸噻嗎洛爾原料藥有關(guān)物質(zhì)TLC法對(duì)2批原料及滴眼液(980502批),光照7 d及27 d的樣品進(jìn)行測(cè)定,與本方法比較結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明HPLC法比TLC法分析靈敏度高且能準(zhǔn)確定量,TLC法檢出的雜斑數(shù)較少且不容易判斷結(jié)果。
表2 HPLC法與TLC法檢查有關(guān)物質(zhì)的比較 樣品
批號(hào)
HPLC法
(雜峰數(shù))
TLC法
(雜斑數(shù))
原料藥
, 百拇醫(yī)藥
960302
960401
1
1
未檢出
未檢出
滴眼液
980502
(光照7 d)
(光照27 d)
4
8
1
, 百拇醫(yī)藥
3
4 樣品測(cè)定
4.1 原料藥 取本品(約相當(dāng)于噻嗎洛爾12.5 mg),精密稱(chēng)定,置25 mL量瓶中,加流動(dòng)相使溶解并稀釋至刻度,作為供試品溶液。精密取供試品溶液1 mL,置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照溶液。取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀,調(diào)節(jié)檢測(cè)靈敏度,使主成分色譜峰高約為記錄儀滿(mǎn)量程的10%~20%,再取供試品溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時(shí)間的3倍(主成分保留時(shí)間應(yīng)在10 min后),除馬來(lái)酸峰之外,供試品溶液的色譜圖中如有雜質(zhì)峰,量取各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對(duì)照溶液的峰面積。結(jié)果見(jiàn)表3。
4.2 滴眼液 精密量取本品1 mL(約相當(dāng)于噻嗎洛爾5 mg)置10 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。精密量取1 mL置100 mL量瓶中,用流動(dòng)相稀釋至刻度作為對(duì)照溶液,照上述方法檢查,應(yīng)符合規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表3。
, 百拇醫(yī)藥
表3 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定結(jié)果 樣品
批號(hào)
對(duì)照峰面積(n=3)
雜質(zhì)峰面積之和
雜質(zhì)量/%
原
料
藥
960401
960402
910302
910401
980102
, 百拇醫(yī)藥
5082
5332
5120
5120
4584
—
—
24
24
—
—
—
0.004
, 百拇醫(yī)藥 0.004
—
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眼
液
970601
980501
980502
980306
980504
5146
4807
4862
, http://www.www.srpcoatings.com
5554
5014
3092
1672
1922
1422
1560
0.60
0.35
0.40
0.26
0.31
5 討論
, 百拇醫(yī)藥
5.1 實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相比例的調(diào)整,以主峰保留時(shí)間在10 min之后為宜,馬來(lái)酸峰與相鄰雜質(zhì)峰基線分離較好。
5.2 方法中規(guī)定記錄色譜圖為主峰保留時(shí)間的3倍,是由于原料藥中間體噻二唑的保留時(shí)間約為26 min,實(shí)驗(yàn)中970601批滴眼液中檢出該雜峰。
5.3 本實(shí)驗(yàn)供試液自然放置24 h后復(fù)測(cè),溶液濃度不變,雜質(zhì)量不增加,比較穩(wěn)定。
參考文獻(xiàn)
1,中國(guó)藥典.1995.二部:46
2,USP.ⅩⅩⅢ.1553
3,BP.1993.1132
(本文于1999年4月16日收到), 百拇醫(yī)藥