血漿中游離梭曼的電鰩乙酰膽堿酯酶抑制測定法
作者：應(yīng)翔宇 阮金秀
單位：北京毒物藥物研究所，100850
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000426 梭曼是一種對體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)有強(qiáng)烈抑制作用的有機(jī)磷化合物。由于梭曼毒性強(qiáng)且在體內(nèi)降解迅速，國外目前主要通過大進(jìn)樣量氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用方法來檢測[1，2]，其優(yōu)點(diǎn)是：(1)靈敏度較高，如檢測下限可達(dá)1.5 pg/ml血漿；(2)可以將梭曼的4個(gè)異構(gòu)體分開，以便研究各異構(gòu)體在體內(nèi)的動力學(xué)過程。不足之處是：檢測設(shè)備價(jià)格昂貴，樣本的預(yù)處理過程比較繁瑣，檢測時(shí)間較長，不適合臨床上對毒劑濃度的快速檢測。基于AChE活性抑制測定有機(jī)磷毒劑濃度的文獻(xiàn)也有報(bào)道，優(yōu)點(diǎn)是靈敏、簡便[3]。然而，該法在檢測血漿中殘留梭曼時(shí)是否準(zhǔn)確可靠，以及如何處理樣本及控制檢測條件，還有待于進(jìn)一步研究。我們以李鳳珍[4]所建的微量羥胺法為基礎(chǔ)，建立了一種靈敏、快速的梭曼檢測方法。
, 百拇醫(yī)藥
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Model 550酶標(biāo)儀是美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，TLL-C臺式高速冷凍離心機(jī)由北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
電鰩AChE由北京毒物藥物研究所郭崇志博士提供，溴化乙酰膽堿(ACh-Br)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站提供，鹽酸羥胺為丹東化工二廠產(chǎn)品，三氯化鐵為北京朝陽區(qū)通惠化工廠產(chǎn)品，高氯酸由北京南尚樂化工廠生產(chǎn)，其余試劑均為分析純。
電鰩AChE用1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)按1∶300(V/V)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配；溴化乙酰膽堿，以pH 4.0HCl配成0.14 mol母液，凍結(jié)保存，臨用前以緩沖液按1∶10稀釋后置于冰浴中；2 mol/L鹽酸羥胺保存于4 ℃冰箱中；堿羥胺溶液是將2 mol/L鹽酸羥胺及3.5 mol NaOH在臨用前以等容積混合配成：0.197 mol/L FeCl3，以0.1 mol HCl配制而成，過濾至清后室溫保存；梭曼由本所二室提供，純度約為97%，現(xiàn)用現(xiàn)配。
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1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，♀，18～22 g；大鼠，♀，180～220 g；均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
1.3 原理 測定經(jīng)電鰩AChE水解后的剩余底物(ACh*Br)量，與ACh加入量相比，其差量代表酶活力。剩余的ACh與羥胺在堿性溶液中作用，生成乙酰羥肟酸，后者在酸性溶液中與高鐵離子生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物，顏色強(qiáng)度與ACh量成正比。在一定范圍內(nèi)，梭曼濃度與電鰩AChE的抑制程度具有線性關(guān)系，梭曼濃度愈高，對酶的抑制力就愈強(qiáng)，呈色就愈深；反之，對酶的抑制則愈弱，呈色也愈淺；根據(jù)A值的變化可以求得梭曼濃度的高低。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 微量羥胺法測定電鰩AChE活性 樣品管：將10 μl電鰩AChE取10 μl經(jīng)1.4.2處理后的上清液及30 μl 1/15 mol/L 磷酸鹽緩沖液在37 ℃氣浴中反應(yīng)10 min后，加入0.014 mol/L ACh50 μl，反應(yīng)總?cè)莘e100 μl，37 ℃反應(yīng)30 min后加入200 μl堿羥胺終止反應(yīng)，然后加入2 mol HCl200 μl混勻，最后加0.197 mol/L FeCL3300 μl顯色。顯色后離心1 min(1 760 g)，吸取上清液300 μl，于492 nm處比色。正常酶管：將10 μl電鰩AChE及40 μl緩沖液在37 ℃氣浴中孵溫10 min，其余步驟皆同樣品管。非酶水解對照管加50 μl緩沖液及50 μl 0.014 mol/LACh，在37 ℃氣浴中同步孵溫30 min，然后加入堿羥胺，1 min后再加入酶樣品，反應(yīng)總?cè)莘e100 μl。ACh標(biāo)準(zhǔn)管加樣與非酶水解對照管相同，置于冰浴中。試劑空白管只加緩沖液。
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已知每管中ACh加量為0.7 μmol，故電鰩AChE在37 ℃1min內(nèi)水解ACh的μmol為：
AChE活力(μmol ACh-min-1*μl-1)=(非酶水解對照管吸光度-樣品管吸光度)*0.7/標(biāo)準(zhǔn)管吸光/30/10
1.4.2 梭曼濃度-電鰩AChE抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.4.2.1 絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線 50 μl生理鹽水+10 μl高氯酸(1 mol/L)，加入50 μl不同濃度梭曼(終濃度：10-9.5～108.2 mol/L)，混勻，-4 ℃離心2.5 min(10?100 g)，取出上清液10 μl，微量羥胺法測定酶活性，根據(jù)梭曼濃度-電鰩AChE抑制關(guān)系求出回歸方程。
1.4.2.2 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線 用小鼠血漿替代生理鹽水，其余方法同1.4.2.1。
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1.4.3 回收率及方法重現(xiàn)性評估 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并據(jù)所測得的梭曼濃度與加入梭曼濃度相比，求出回收率。
1.4.4 大鼠血液中梭曼殘留濃度的測定 大鼠按415 μg/kg(5LD50)尾靜脈注射梭曼(約0.2 ml)后15、30 s、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min分別從眼球取血50 μl，并立即加入18 μl高氯酸(1 mol/L)終止梭曼與血液中解毒酶繼續(xù)反應(yīng)，充分混勻后，-4 ℃離心2.5 min(10?100 g)，上清液按1∶85(V/V)稀釋后取出10 μl，羥胺法測定酶活性，并根據(jù)梭曼-電鰩AChE抑制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成血液中的梭曼濃度。
2 結(jié)果
2.1 電鰩AChE濃度與活力的關(guān)系 電鰩AChE按1∶300稀釋后，觀察電鰩AChE用量與反應(yīng)速度的相互關(guān)系。電鰩AChE稀釋液在2～10 μl范圍內(nèi)，酶用量與活力有較好的線性關(guān)系，故將酶用量定為10 μl。經(jīng)計(jì)算求得，該酶在37 ℃可分解乙酰膽堿的量1.87 nmol ACh*min-1*μl-1。
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2.2 梭曼與電鰩AChE抑制的量-效關(guān)系 圖1表明，梭曼濃度在10-9.7～10-8.0 mol/L溶液范圍內(nèi)，梭曼-電鰩AChE抑制具有較好的線性關(guān)系，超出該范圍，梭曼對電鰩AChE的抑制作用分別趨于平臺。
圖1 梭曼與電鰩AChE抑制的量-效關(guān)系
2.3 梭曼-電鰩AChE抑制絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線 當(dāng)梭曼濃度在10-9.5～10-8.2 mol/L溶液時(shí)，梭曼濃度與AChE抑制線性關(guān)系良好，回歸方程為，Y=557-57X，相關(guān)系數(shù)r>0.999。
2.4 梭曼-電鰩AChE抑制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2表明，當(dāng)梭曼濃度在10-9.5～10-8.2 mol/L血漿時(shí)，梭曼濃度與AChE抑制線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=559-56X，相關(guān)系數(shù)r>0.998。
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圖2 梭曼抑制電鰩AChE的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.5 梭曼檢測方法的回收率及重現(xiàn)性
2.5.1 日內(nèi)重現(xiàn)性 一日內(nèi)重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出回收率及日內(nèi)變異系數(shù)(表1)。
表1 梭曼檢測方法的日內(nèi)重現(xiàn)性(
±s,n=4) 梭曼濃度(mol/L)
回收率(%)
變異系數(shù)(%)
10-9.5
65.6±4.88
7.44
, 百拇醫(yī)藥
10-9.3
78.7±4.93
6.26
10-9.0
98.5±2.88
2.92
10-8.8
117.9±2.91
2.47
10-8.2
104.9±6.97
, 百拇醫(yī)藥
6.64
2.5.2 日間重現(xiàn)性 每日重復(fù)1次實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d，求出回收率，同時(shí)判斷出方法的日間變異情況(表2)。
表2 梭曼檢測方法的日間重現(xiàn)性(±s,n=4) 梭曼濃度(mol/L)
回收率(%)
變異系數(shù)(%)
10-9.5
76.1±6.57
8.63
10-9.3
, 百拇醫(yī)藥
79.2±7.04
8.89
10-9.0
98.1±8.48
8.64
10-8.8
108.2±9.92
9.17
10-8.2
96.7±6.63
6.85
, 百拇醫(yī)藥 2.6 電鰩AChE抑制法測定大鼠血液中的梭曼殘留濃度
為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的可靠性，我們測定了大鼠血液中的梭曼殘留濃度，結(jié)果表明，該法能反映出梭曼在大鼠血液中的消除過程(圖3)，重復(fù)性較好，提示用酶法檢測血液中的游離梭曼是可行的。
圖3 梭曼在大鼠血液中的濃度-時(shí)間曲線
3 討論
梭曼與解毒酶作用迅速，那么要想準(zhǔn)確定量生物樣本中的梭曼殘留濃度，就要求在終止血漿中解毒酶與梭曼繼續(xù)反應(yīng)時(shí)，終止劑必須具備以下幾個(gè)條件：終止反應(yīng)迅速，對梭曼無明顯的降解作用，對后續(xù)的羥胺法測量系統(tǒng)，尤其是對外加電鰩AChE活性沒有明顯影響。梭曼易溶解于有機(jī)溶劑，故可以考慮用有機(jī)溶劑來提取血漿中游離梭曼，但在提取后要加以濃縮，在蒸發(fā)溶劑的過程中，梭曼有可能也隨之揮發(fā)掉，從而降低回收率；另一個(gè)思路就是考慮用蛋白質(zhì)沉淀劑來終止酶與梭曼的進(jìn)一步反應(yīng)，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，我們先用1 mol/L高氯酸終止反應(yīng)，然后再加入等當(dāng)量的氫氧化鉀(1 mol/L)將反應(yīng)系統(tǒng)的pH值調(diào)至6～8，由于反應(yīng)系統(tǒng)酸堿度接近于中性，可能導(dǎo)致了某些蛋白質(zhì)重新復(fù)性，并結(jié)合了更多的梭曼，使得回收率僅為40%～60%，明顯低于高氯酸單獨(dú)使用時(shí)的回收率，這一點(diǎn)Loke[6]的報(bào)道不同于我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此我們認(rèn)為，高氯酸自身在沉淀蛋白時(shí)，具有終止反應(yīng)迅速，且沒有明顯降解梭曼的作用，符合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊�。�?shí)驗(yàn)中，我們還試著用三氯乙酸、乙醇、甲醇等沉淀蛋白手段，以及瞬間高熱和超濾等方式來終止反應(yīng)，但存在終止反應(yīng)慢及對電鰩AChE活性有明顯的抑制作用等缺點(diǎn)。
, http://www.www.srpcoatings.com
參考文獻(xiàn)
[1] Degenhardt-Langelaan CEAM,Kientz CE.Capillary gas chromatographic analysis of nerve agents using large volume injections.J Chroma,1996,723:210-214.
[2] Karlsson B,Fredriksson SA,Sellstrom A,et al.The protective effect of nimodipine,a clalcium antagonist,and its influence on soman clearance in the anaesthetized rabbit.J Pharm Pharmacol,1994,46:123-127.
[3] Hammond PS,Forster JS.A microassay-based procedure for measuing low levels of toxic organophosphorus compounds through acetylcholinesterase inhibition.Analy Biochem,1989,180:380-383.
, http://www.www.srpcoatings.com
[4] 李鳳珍，孫曼霽.微量羥胺比色法測量膽堿酯酶活性.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1986，10：211-214.
[5] Benschop HP,Konings CAG，Genderen J,et al.Isolation,in vitro activity,and acute toxicity in mice of the four stereosiomers of soman.Fundam Appl Toxicol，1984，4:S84-95.
[6] Loke WK,Karlsson B,Waara L,et al.Enzyme-based microassay for accurate determination of soman in blood samples.Analy Biochem,1998，257:12-19.
(收稿日期：1999-07-02), 百拇醫(yī)藥
單位：北京毒物藥物研究所，100850
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衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000426 梭曼是一種對體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)有強(qiáng)烈抑制作用的有機(jī)磷化合物。由于梭曼毒性強(qiáng)且在體內(nèi)降解迅速，國外目前主要通過大進(jìn)樣量氣相色譜或氣-質(zhì)聯(lián)用方法來檢測[1，2]，其優(yōu)點(diǎn)是：(1)靈敏度較高，如檢測下限可達(dá)1.5 pg/ml血漿；(2)可以將梭曼的4個(gè)異構(gòu)體分開，以便研究各異構(gòu)體在體內(nèi)的動力學(xué)過程。不足之處是：檢測設(shè)備價(jià)格昂貴，樣本的預(yù)處理過程比較繁瑣，檢測時(shí)間較長，不適合臨床上對毒劑濃度的快速檢測。基于AChE活性抑制測定有機(jī)磷毒劑濃度的文獻(xiàn)也有報(bào)道，優(yōu)點(diǎn)是靈敏、簡便[3]。然而，該法在檢測血漿中殘留梭曼時(shí)是否準(zhǔn)確可靠，以及如何處理樣本及控制檢測條件，還有待于進(jìn)一步研究。我們以李鳳珍[4]所建的微量羥胺法為基礎(chǔ)，建立了一種靈敏、快速的梭曼檢測方法。
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1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料 Model 550酶標(biāo)儀是美國BIO-RAD公司產(chǎn)品，TLL-C臺式高速冷凍離心機(jī)由北京四環(huán)科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。
電鰩AChE由北京毒物藥物研究所郭崇志博士提供，溴化乙酰膽堿(ACh-Br)由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥材供應(yīng)站提供，鹽酸羥胺為丹東化工二廠產(chǎn)品，三氯化鐵為北京朝陽區(qū)通惠化工廠產(chǎn)品，高氯酸由北京南尚樂化工廠生產(chǎn)，其余試劑均為分析純。
電鰩AChE用1/15 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)按1∶300(V/V)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配；溴化乙酰膽堿，以pH 4.0HCl配成0.14 mol母液，凍結(jié)保存，臨用前以緩沖液按1∶10稀釋后置于冰浴中；2 mol/L鹽酸羥胺保存于4 ℃冰箱中；堿羥胺溶液是將2 mol/L鹽酸羥胺及3.5 mol NaOH在臨用前以等容積混合配成：0.197 mol/L FeCl3，以0.1 mol HCl配制而成，過濾至清后室溫保存；梭曼由本所二室提供，純度約為97%，現(xiàn)用現(xiàn)配。
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1.2 實(shí)驗(yàn)動物 昆明種小鼠，♀，18～22 g；大鼠，♀，180～220 g；均由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
1.3 原理 測定經(jīng)電鰩AChE水解后的剩余底物(ACh*Br)量，與ACh加入量相比，其差量代表酶活力。剩余的ACh與羥胺在堿性溶液中作用，生成乙酰羥肟酸，后者在酸性溶液中與高鐵離子生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物，顏色強(qiáng)度與ACh量成正比。在一定范圍內(nèi)，梭曼濃度與電鰩AChE的抑制程度具有線性關(guān)系，梭曼濃度愈高，對酶的抑制力就愈強(qiáng)，呈色就愈深；反之，對酶的抑制則愈弱，呈色也愈淺；根據(jù)A值的變化可以求得梭曼濃度的高低。
1.4 實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 微量羥胺法測定電鰩AChE活性 樣品管：將10 μl電鰩AChE取10 μl經(jīng)1.4.2處理后的上清液及30 μl 1/15 mol/L 磷酸鹽緩沖液在37 ℃氣浴中反應(yīng)10 min后，加入0.014 mol/L ACh50 μl，反應(yīng)總?cè)莘e100 μl，37 ℃反應(yīng)30 min后加入200 μl堿羥胺終止反應(yīng)，然后加入2 mol HCl200 μl混勻，最后加0.197 mol/L FeCL3300 μl顯色。顯色后離心1 min(1 760 g)，吸取上清液300 μl，于492 nm處比色。正常酶管：將10 μl電鰩AChE及40 μl緩沖液在37 ℃氣浴中孵溫10 min，其余步驟皆同樣品管。非酶水解對照管加50 μl緩沖液及50 μl 0.014 mol/LACh，在37 ℃氣浴中同步孵溫30 min，然后加入堿羥胺，1 min后再加入酶樣品，反應(yīng)總?cè)莘e100 μl。ACh標(biāo)準(zhǔn)管加樣與非酶水解對照管相同，置于冰浴中。試劑空白管只加緩沖液。
, 百拇醫(yī)藥
已知每管中ACh加量為0.7 μmol，故電鰩AChE在37 ℃1min內(nèi)水解ACh的μmol為：
AChE活力(μmol ACh-min-1*μl-1)=(非酶水解對照管吸光度-樣品管吸光度)*0.7/標(biāo)準(zhǔn)管吸光/30/10
1.4.2 梭曼濃度-電鰩AChE抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線
1.4.2.1 絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線 50 μl生理鹽水+10 μl高氯酸(1 mol/L)，加入50 μl不同濃度梭曼(終濃度：10-9.5～108.2 mol/L)，混勻，-4 ℃離心2.5 min(10?100 g)，取出上清液10 μl，微量羥胺法測定酶活性，根據(jù)梭曼濃度-電鰩AChE抑制關(guān)系求出回歸方程。
1.4.2.2 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線 用小鼠血漿替代生理鹽水，其余方法同1.4.2.1。
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1.4.3 回收率及方法重現(xiàn)性評估 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，并據(jù)所測得的梭曼濃度與加入梭曼濃度相比，求出回收率。
1.4.4 大鼠血液中梭曼殘留濃度的測定 大鼠按415 μg/kg(5LD50)尾靜脈注射梭曼(約0.2 ml)后15、30 s、1、1.5、2、3、4、6、8、10 min分別從眼球取血50 μl，并立即加入18 μl高氯酸(1 mol/L)終止梭曼與血液中解毒酶繼續(xù)反應(yīng)，充分混勻后，-4 ℃離心2.5 min(10?100 g)，上清液按1∶85(V/V)稀釋后取出10 μl，羥胺法測定酶活性，并根據(jù)梭曼-電鰩AChE抑制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成血液中的梭曼濃度。
2 結(jié)果
2.1 電鰩AChE濃度與活力的關(guān)系 電鰩AChE按1∶300稀釋后，觀察電鰩AChE用量與反應(yīng)速度的相互關(guān)系。電鰩AChE稀釋液在2～10 μl范圍內(nèi)，酶用量與活力有較好的線性關(guān)系，故將酶用量定為10 μl。經(jīng)計(jì)算求得，該酶在37 ℃可分解乙酰膽堿的量1.87 nmol ACh*min-1*μl-1。
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2.2 梭曼與電鰩AChE抑制的量-效關(guān)系 圖1表明，梭曼濃度在10-9.7～10-8.0 mol/L溶液范圍內(nèi)，梭曼-電鰩AChE抑制具有較好的線性關(guān)系，超出該范圍，梭曼對電鰩AChE的抑制作用分別趨于平臺。
圖1 梭曼與電鰩AChE抑制的量-效關(guān)系
2.3 梭曼-電鰩AChE抑制絕對標(biāo)準(zhǔn)曲線 當(dāng)梭曼濃度在10-9.5～10-8.2 mol/L溶液時(shí)，梭曼濃度與AChE抑制線性關(guān)系良好，回歸方程為，Y=557-57X，相關(guān)系數(shù)r>0.999。
2.4 梭曼-電鰩AChE抑制相對標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2表明，當(dāng)梭曼濃度在10-9.5～10-8.2 mol/L血漿時(shí)，梭曼濃度與AChE抑制線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=559-56X，相關(guān)系數(shù)r>0.998。
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圖2 梭曼抑制電鰩AChE的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線
2.5 梭曼檢測方法的回收率及重現(xiàn)性
2.5.1 日內(nèi)重現(xiàn)性 一日內(nèi)重復(fù)4次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出回收率及日內(nèi)變異系數(shù)(表1)。
表1 梭曼檢測方法的日內(nèi)重現(xiàn)性(
±s,n=4) 梭曼濃度(mol/L)回收率(%)
變異系數(shù)(%)
10-9.5
65.6±4.88
7.44
, 百拇醫(yī)藥
10-9.3
78.7±4.93
6.26
10-9.0
98.5±2.88
2.92
10-8.8
117.9±2.91
2.47
10-8.2
104.9±6.97
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2.5.2 日間重現(xiàn)性 每日重復(fù)1次實(shí)驗(yàn)，連續(xù)4 d，求出回收率，同時(shí)判斷出方法的日間變異情況(表2)。
表2 梭曼檢測方法的日間重現(xiàn)性(
±s,n=4) 梭曼濃度(mol/L)回收率(%)
變異系數(shù)(%)
10-9.5
76.1±6.57
8.63
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79.2±7.04
8.89
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98.1±8.48
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9.17
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96.7±6.63
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, 百拇醫(yī)藥 2.6 電鰩AChE抑制法測定大鼠血液中的梭曼殘留濃度
為進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的可靠性，我們測定了大鼠血液中的梭曼殘留濃度，結(jié)果表明，該法能反映出梭曼在大鼠血液中的消除過程(圖3)，重復(fù)性較好，提示用酶法檢測血液中的游離梭曼是可行的。
圖3 梭曼在大鼠血液中的濃度-時(shí)間曲線
3 討論
梭曼與解毒酶作用迅速，那么要想準(zhǔn)確定量生物樣本中的梭曼殘留濃度，就要求在終止血漿中解毒酶與梭曼繼續(xù)反應(yīng)時(shí)，終止劑必須具備以下幾個(gè)條件：終止反應(yīng)迅速，對梭曼無明顯的降解作用，對后續(xù)的羥胺法測量系統(tǒng)，尤其是對外加電鰩AChE活性沒有明顯影響。梭曼易溶解于有機(jī)溶劑，故可以考慮用有機(jī)溶劑來提取血漿中游離梭曼，但在提取后要加以濃縮，在蒸發(fā)溶劑的過程中，梭曼有可能也隨之揮發(fā)掉，從而降低回收率；另一個(gè)思路就是考慮用蛋白質(zhì)沉淀劑來終止酶與梭曼的進(jìn)一步反應(yīng)，預(yù)實(shí)驗(yàn)階段，我們先用1 mol/L高氯酸終止反應(yīng)，然后再加入等當(dāng)量的氫氧化鉀(1 mol/L)將反應(yīng)系統(tǒng)的pH值調(diào)至6～8，由于反應(yīng)系統(tǒng)酸堿度接近于中性，可能導(dǎo)致了某些蛋白質(zhì)重新復(fù)性，并結(jié)合了更多的梭曼，使得回收率僅為40%～60%，明顯低于高氯酸單獨(dú)使用時(shí)的回收率，這一點(diǎn)Loke[6]的報(bào)道不同于我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此我們認(rèn)為，高氯酸自身在沉淀蛋白時(shí)，具有終止反應(yīng)迅速，且沒有明顯降解梭曼的作用，符合本實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊�。�?shí)驗(yàn)中，我們還試著用三氯乙酸、乙醇、甲醇等沉淀蛋白手段，以及瞬間高熱和超濾等方式來終止反應(yīng)，但存在終止反應(yīng)慢及對電鰩AChE活性有明顯的抑制作用等缺點(diǎn)。
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(收稿日期：1999-07-02), 百拇醫(yī)藥