比色法測定氨基胍
作者:泮鋒鋼 鹿明
單位:泮鋒鋼 鹿明(天津大學(xué)化工學(xué)院 天津 300072)
關(guān)鍵詞:
藥物分析雜志000329 氨基胍是合成許多醫(yī)藥、染料、炸藥的原料,近期用于治療糖尿病的研究[1~4]非;钴S,并作為誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶抑制劑[5]用于麻醉領(lǐng)域。但其測定方法的報(bào)道十分稀少。測定胍的比色法[6]干擾多,檢測限低。已有文獻(xiàn)報(bào)道[7],在強(qiáng)酸介質(zhì)中,對二甲氨基苯甲醛(簡稱DMBA)與肼形成橙色物質(zhì)用于測定肼。研究發(fā)現(xiàn),所形成的橙色物質(zhì)與少量氨基胍反應(yīng)而明顯褪色,該反應(yīng)在低濃度下(0~0.001 mol.L-1)滿足比耳定律。本文據(jù)此建立了測定氨基胍的比色法。本法具有干擾少,測定范圍廣,操作簡單,靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。利用本法測定氨基胍結(jié)晶母液中的氨基胍含量,結(jié)果令人滿意。血清的回收試驗(yàn)也收到良好的結(jié)果。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與試劑
721分光光度計(jì)(上海第三儀器廠)。對二甲氨基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液:用對二甲氨基苯甲醛(分析純)配制,CDMBA=0.001 0 mol.L-1,CHCl=0.5 mol.L-1;硫酸肼(分析純);氨基胍標(biāo)準(zhǔn)溶液:用重碳酸氨基胍(分析純)配制,C氨基胍=0.001 0 mol.L-1,CHCl=0.5 mol.L-1。
2 實(shí)驗(yàn)方法
于一系列25 mL具塞刻度比色管中,分別加入二甲氨基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL,過量的硫酸肼(約0.01 g),再分別向各比色管中加入適量的0.5 mol.L-1的鹽酸或氨基胍標(biāo)準(zhǔn)溶液。加0.5 mol.L-1的鹽酸至8 mL,振蕩均勻,60 ℃水浴加熱10 min,冷卻后加入乙醇15 mL,充分顯色,加0.5 mol.L-1鹽酸至刻度,以水為參比,在460 nm處,用1 cm比色皿,分別測定空白試樣吸光度A0和加入氨基胍試樣的吸光度A,ΔA=A0-A,樣品測定時依相同步驟操作。
, 百拇醫(yī)藥
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 吸收波長選擇 按“2”的方法實(shí)驗(yàn),DMBA與肼形成的橙色溶液在λ=460 nm有最大吸收,選此為測定波長。
3.2 酸度的影響 由圖1可知,低濃度的酸有利于提高靈敏度。但研究發(fā)現(xiàn)酸濃度太低褪色困難,CHCl<0.4 mol.L-1時,反應(yīng)不再滿足比耳定律,且褪色時間過長。本實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mol.L-1鹽酸。
3.3 硫酸肼與DMBA用量的影響 室溫下,硫酸肼只需0.01 g即已過量,多加對A0無影響。A0與DMBA用量呈線性關(guān)系:A0=0.25×VDMBA.mL-1。本實(shí)驗(yàn)選擇加入 DMBA標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL較為適宜。
, http://www.www.srpcoatings.com
3.4 乙醇用量的影響 乙醇可以改變介質(zhì)環(huán)境,提高吸光度,其影響見圖2。加入乙醇可提高本方法的靈敏度,另外,隨著乙醇加入量的增加,介質(zhì)極性下降,褪色困難。本方法采用先在水介質(zhì)中完成褪色反應(yīng),再加入適量乙醇的測定方法。本實(shí)驗(yàn)選擇加入乙醇15 mL。
圖1 HCl濃度對吸光度的影響
圖2 乙醇用量對吸光度的影響
3.5 溫度與時間的影響 實(shí)驗(yàn)表明,在5~30 ℃范圍內(nèi),體系的吸光度長時間穩(wěn)定,故可在室溫下實(shí)驗(yàn),對時間無嚴(yán)格要求。
3.6 工作曲線 在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下,該方法測定氨基胍的檢測限為0.2 μg.mL-1,其濃度在0~5.0 μg.mL-1范圍內(nèi)與ΔA呈線性關(guān)系,其回歸方程為ΔA=-0.005 2+0.089C,r為0.998,RSD為3.3%,n=6。
, 百拇醫(yī)藥
3.7 干擾實(shí)驗(yàn) 在前述最佳實(shí)驗(yàn)條件下,本文考察了氨基化合物如胍、脲、胺、亞胺、氨基酸等,對測定均不發(fā)生干擾。
3.8 樣品分析 按文獻(xiàn)[8]合成硫酸氨基胍,結(jié)晶母液中含有氨基胍和肼,由于肼是本法測定中過量加入的試劑,所以母液中的肼不會干擾測定。將結(jié)晶母液用0.5 mol.L-1鹽酸稀釋,測定其氨基胍含量,并在樣品中加入已知量的氨基胍,按本方法測定含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。溶液中的其他氨基化合物,由于過量肼的存在,不會與DMBA反應(yīng),故不干擾測定。
表1 合成硫酸氨基胍結(jié)晶母液測定結(jié)果(n=6) 樣號
含量平均值
/μg.mL-1
RSD
, 百拇醫(yī)藥
/%
回收率
平均值
/%
RSD
/%
1
1.3
3.5
100
2.8
2
1.4
, http://www.www.srpcoatings.com 4.3
103
3.6
3.9 血清的回收試驗(yàn) 取健康人血清2.00 mL,加入7%的三氯乙酸3 mL,混勻后于3 500 r.min-1的離心機(jī)中離心15 min。移取清液2.00 mL,加入不同量的氨基胍,定容為10 mL,從中移取2.00 mL溶液,按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定;厥战Y(jié)果列于表2。表2 血清的回收試驗(yàn)結(jié)果(n=4) 樣號
加入量
/μg.mL-1
回收率
/%
, http://www.www.srpcoatings.com
RSD
/%
1
0
-
-
1
3.0
97
3.2
2
5.0
102
2.8
, http://www.www.srpcoatings.com
3.10 反應(yīng)機(jī)理 DMBA與肼發(fā)生可逆反應(yīng),生成(Ⅰ),由于該體系的大共軛體系,相當(dāng)穩(wěn)定,不易與其他氨基化合物反應(yīng)。但DMBA可以與氨基胍反應(yīng)消耗掉DMBA,二者反應(yīng)摩爾比為1∶1,隨著DMBA的消耗,平衡移動,(Ⅰ)分解使顏色褪去。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜分析,推測DMBA與氨基胍反應(yīng)生成(Ⅱ),其芳香性五元環(huán)具有更高的穩(wěn)定性,且稀溶液條件下,有利于分子內(nèi)環(huán)合,所以使(Ⅰ)褪色。
參考文獻(xiàn)
1,Skamarawskas John T,Mckay Alan C,Hunt James V.Aminoguanidine and its prooxidant effects on an experimental model of protein glycation.Fre Rad Biol Med,1996,21(6):801
, http://www.www.srpcoatings.com
2,Kawakami Musanobu.Aminoguanidine.Horumon to Rinsho,1995,43(2):189
3,Hill Michael A,Ege Elizabeth A.Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats:effort of aminoguanidine treatment.Diabetes,1994,43(12):1450
4,李曼,曾根博仁.氨基胍.日本醫(yī)學(xué)介紹,1997,18(8):364
5,張生鎖,吳新民.觀察選擇性誘導(dǎo)型NO合成酶抑制劑氨基胍對內(nèi)毒素休克犬血流動力學(xué)的影響.中華麻醉學(xué)雜志,1997,17(8):472
6,夏錦堯.有機(jī)化合物及藥物的比色法和熒光分析法.北京:中國人民公安大學(xué)出版社,1989.208
7,張志賢,張瑞鎬.有機(jī)官能團(tuán)定量分析.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1990.376
8,鄧曉臨,王斌,王碩等.精細(xì)化工商品生產(chǎn)技術(shù)(常用醫(yī)藥化學(xué)品專集).長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1994.110
(本文于1999年7月15日收到), 百拇醫(yī)藥
單位:泮鋒鋼 鹿明(天津大學(xué)化工學(xué)院 天津 300072)
關(guān)鍵詞:
藥物分析雜志000329 氨基胍是合成許多醫(yī)藥、染料、炸藥的原料,近期用于治療糖尿病的研究[1~4]非;钴S,并作為誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶抑制劑[5]用于麻醉領(lǐng)域。但其測定方法的報(bào)道十分稀少。測定胍的比色法[6]干擾多,檢測限低。已有文獻(xiàn)報(bào)道[7],在強(qiáng)酸介質(zhì)中,對二甲氨基苯甲醛(簡稱DMBA)與肼形成橙色物質(zhì)用于測定肼。研究發(fā)現(xiàn),所形成的橙色物質(zhì)與少量氨基胍反應(yīng)而明顯褪色,該反應(yīng)在低濃度下(0~0.001 mol.L-1)滿足比耳定律。本文據(jù)此建立了測定氨基胍的比色法。本法具有干擾少,測定范圍廣,操作簡單,靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。利用本法測定氨基胍結(jié)晶母液中的氨基胍含量,結(jié)果令人滿意。血清的回收試驗(yàn)也收到良好的結(jié)果。
, 百拇醫(yī)藥
1 儀器與試劑
721分光光度計(jì)(上海第三儀器廠)。對二甲氨基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液:用對二甲氨基苯甲醛(分析純)配制,CDMBA=0.001 0 mol.L-1,CHCl=0.5 mol.L-1;硫酸肼(分析純);氨基胍標(biāo)準(zhǔn)溶液:用重碳酸氨基胍(分析純)配制,C氨基胍=0.001 0 mol.L-1,CHCl=0.5 mol.L-1。
2 實(shí)驗(yàn)方法
于一系列25 mL具塞刻度比色管中,分別加入二甲氨基苯甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL,過量的硫酸肼(約0.01 g),再分別向各比色管中加入適量的0.5 mol.L-1的鹽酸或氨基胍標(biāo)準(zhǔn)溶液。加0.5 mol.L-1的鹽酸至8 mL,振蕩均勻,60 ℃水浴加熱10 min,冷卻后加入乙醇15 mL,充分顯色,加0.5 mol.L-1鹽酸至刻度,以水為參比,在460 nm處,用1 cm比色皿,分別測定空白試樣吸光度A0和加入氨基胍試樣的吸光度A,ΔA=A0-A,樣品測定時依相同步驟操作。
, 百拇醫(yī)藥
3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1 吸收波長選擇 按“2”的方法實(shí)驗(yàn),DMBA與肼形成的橙色溶液在λ=460 nm有最大吸收,選此為測定波長。
3.2 酸度的影響 由圖1可知,低濃度的酸有利于提高靈敏度。但研究發(fā)現(xiàn)酸濃度太低褪色困難,CHCl<0.4 mol.L-1時,反應(yīng)不再滿足比耳定律,且褪色時間過長。本實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mol.L-1鹽酸。
3.3 硫酸肼與DMBA用量的影響 室溫下,硫酸肼只需0.01 g即已過量,多加對A0無影響。A0與DMBA用量呈線性關(guān)系:A0=0.25×VDMBA.mL-1。本實(shí)驗(yàn)選擇加入 DMBA標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL較為適宜。
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3.4 乙醇用量的影響 乙醇可以改變介質(zhì)環(huán)境,提高吸光度,其影響見圖2。加入乙醇可提高本方法的靈敏度,另外,隨著乙醇加入量的增加,介質(zhì)極性下降,褪色困難。本方法采用先在水介質(zhì)中完成褪色反應(yīng),再加入適量乙醇的測定方法。本實(shí)驗(yàn)選擇加入乙醇15 mL。
圖1 HCl濃度對吸光度的影響
圖2 乙醇用量對吸光度的影響
3.5 溫度與時間的影響 實(shí)驗(yàn)表明,在5~30 ℃范圍內(nèi),體系的吸光度長時間穩(wěn)定,故可在室溫下實(shí)驗(yàn),對時間無嚴(yán)格要求。
3.6 工作曲線 在上述選定的最佳實(shí)驗(yàn)條件下,該方法測定氨基胍的檢測限為0.2 μg.mL-1,其濃度在0~5.0 μg.mL-1范圍內(nèi)與ΔA呈線性關(guān)系,其回歸方程為ΔA=-0.005 2+0.089C,r為0.998,RSD為3.3%,n=6。
, 百拇醫(yī)藥
3.7 干擾實(shí)驗(yàn) 在前述最佳實(shí)驗(yàn)條件下,本文考察了氨基化合物如胍、脲、胺、亞胺、氨基酸等,對測定均不發(fā)生干擾。
3.8 樣品分析 按文獻(xiàn)[8]合成硫酸氨基胍,結(jié)晶母液中含有氨基胍和肼,由于肼是本法測定中過量加入的試劑,所以母液中的肼不會干擾測定。將結(jié)晶母液用0.5 mol.L-1鹽酸稀釋,測定其氨基胍含量,并在樣品中加入已知量的氨基胍,按本方法測定含量,計(jì)算回收率,結(jié)果見表1。溶液中的其他氨基化合物,由于過量肼的存在,不會與DMBA反應(yīng),故不干擾測定。
表1 合成硫酸氨基胍結(jié)晶母液測定結(jié)果(n=6) 樣號
含量平均值
/μg.mL-1
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, 百拇醫(yī)藥
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回收率
平均值
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1
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3.9 血清的回收試驗(yàn) 取健康人血清2.00 mL,加入7%的三氯乙酸3 mL,混勻后于3 500 r.min-1的離心機(jī)中離心15 min。移取清液2.00 mL,加入不同量的氨基胍,定容為10 mL,從中移取2.00 mL溶液,按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定;厥战Y(jié)果列于表2。表2 血清的回收試驗(yàn)結(jié)果(n=4) 樣號
加入量
/μg.mL-1
回收率
/%
, http://www.www.srpcoatings.com
RSD
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3.0
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, http://www.www.srpcoatings.com
3.10 反應(yīng)機(jī)理 DMBA與肼發(fā)生可逆反應(yīng),生成(Ⅰ),由于該體系的大共軛體系,相當(dāng)穩(wěn)定,不易與其他氨基化合物反應(yīng)。但DMBA可以與氨基胍反應(yīng)消耗掉DMBA,二者反應(yīng)摩爾比為1∶1,隨著DMBA的消耗,平衡移動,(Ⅰ)分解使顏色褪去。通過對反應(yīng)產(chǎn)物的紅外光譜分析,推測DMBA與氨基胍反應(yīng)生成(Ⅱ),其芳香性五元環(huán)具有更高的穩(wěn)定性,且稀溶液條件下,有利于分子內(nèi)環(huán)合,所以使(Ⅰ)褪色。
參考文獻(xiàn)
1,Skamarawskas John T,Mckay Alan C,Hunt James V.Aminoguanidine and its prooxidant effects on an experimental model of protein glycation.Fre Rad Biol Med,1996,21(6):801
, http://www.www.srpcoatings.com
2,Kawakami Musanobu.Aminoguanidine.Horumon to Rinsho,1995,43(2):189
3,Hill Michael A,Ege Elizabeth A.Active and passive mechanical properties of isolated arterioles from STZ-induced diabetic rats:effort of aminoguanidine treatment.Diabetes,1994,43(12):1450
4,李曼,曾根博仁.氨基胍.日本醫(yī)學(xué)介紹,1997,18(8):364
5,張生鎖,吳新民.觀察選擇性誘導(dǎo)型NO合成酶抑制劑氨基胍對內(nèi)毒素休克犬血流動力學(xué)的影響.中華麻醉學(xué)雜志,1997,17(8):472
6,夏錦堯.有機(jī)化合物及藥物的比色法和熒光分析法.北京:中國人民公安大學(xué)出版社,1989.208
7,張志賢,張瑞鎬.有機(jī)官能團(tuán)定量分析.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1990.376
8,鄧曉臨,王斌,王碩等.精細(xì)化工商品生產(chǎn)技術(shù)(常用醫(yī)藥化學(xué)品專集).長沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,1994.110
(本文于1999年7月15日收到), 百拇醫(yī)藥