Propentofylline 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
作者：張煜 巴圖
單位：白求恩醫(yī)科大學(xué)，長(zhǎng)春 130021
關(guān)鍵詞：腺苷；Propentofylline；過(guò)氧化氫
中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志000115
摘 要：本研究探討Propentofylline對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其它的作用機(jī)制。采用魯米諾依賴的全血化學(xué)發(fā)光法測(cè)定fMLP激活的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。結(jié)果顯示Propentofylline以濃度依賴形式抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，并增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用，但不影響NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果提示，Propentofylline通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷水平，增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。這種作用也可能是Propentofylline保護(hù)心腦組織損傷的機(jī)制之一。
The Effects of Propentofylline on Human Neutrophils
, http://www.www.srpcoatings.com
ZHANG Yu BA Tu
(Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract：In this study, we tested the effects and mechanisms of propentofylline on human neutrophils. The neutrophils were stimulated by fMLP (formyl-MetLeuPhe) and hydrogen peroxide was determined by the luminol amplified chemiluminescence. Results showned that propentofylline inhibited the hydrogen peroxide production by neutrophils in concentration-dependent manner. The inhibitory effect of adenosine on fMLP-stimulated neutrophil hydrogen peroxide was markedly increased in the presence of propentofylline. But that of NECA (5`-N-ethylcarboxamidoadenosine) was unaffected, indicated that the inhibitory effect of propentofylline on neutrophils was mediated by inhibiting adenosine uptake and increasing the local concentration of adenosine. This effect could be a mechanism of the protective effects of propentofylline on the ischemia of brain and heart.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：adenosine;propentofylline;hydrogen peroxide
Propentofylline，是新的黃嘌呤衍生物，已經(jīng)顯示對(duì)心腦組織缺血具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其擴(kuò)張血管，增加能量恢復(fù)及降低腦組織水腫有關(guān)[1]。由于中性粒細(xì)胞在組織缺血再灌注損傷中起著重要的作用，因此，我們研究了Propentofylline 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其它的作用機(jī)制。用甲酰基-甲硫氨基-亮氨�；�-苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒細(xì)胞，采用魯米諾反應(yīng)測(cè)量中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫含量。
材料和方法
1.試劑
腺苷或其衍生物N-已基-羧酰氨基腺苷(NECA)的濃度為0.01, 0.1, 1, 10 μmol.L-1。 Propentofylline的濃度為10, 30, 100, 300, 1000μmol.L-1。Hank 平衡鹽溶液。細(xì)胞激化劑(fMLP)1μmol.L-1。
, http://www.www.srpcoatings.com
2. 測(cè)定方法
2.1 中性粒細(xì)胞的分離
取健康成年人血30～50 ml,肝素抗凝, 用Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，參照Wright法[2]進(jìn)行，離心后收集中性粒細(xì)胞，用PBS沖洗二次，蒸溜水溶解污染的紅細(xì)胞。沖洗后的細(xì)胞再用Hank 平衡鹽溶液配成理想的濃度1×106/ml，計(jì)數(shù)所得細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞比例>90%(革蘭染色)及細(xì)胞活力>95%(臺(tái)盼藍(lán)拒染)為合格。
2.2 過(guò)氧化氫的測(cè)定
采用魯米諾依賴的全血化學(xué)發(fā)光法(CL) 參照Wymann法[3]進(jìn)行，這是測(cè)定中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)非常敏感的方法。不同濃度的藥物加到含中性粒細(xì)胞的試管中，在37°C條件下水浴5 min后，fMLP激活細(xì)胞，細(xì)胞釋放的CL用Luminometer測(cè)定。CL峰值代表中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫的量。數(shù)據(jù)表達(dá)采用與對(duì)照組的百分比。所有藥物在無(wú)細(xì)胞情況下均不影響魯米諾系統(tǒng)。
, 百拇醫(yī)藥
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)均為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，來(lái)源于4～8個(gè)試驗(yàn)。顯著性差異用t檢驗(yàn)方法測(cè)定。
結(jié)果
1. Propentofylline 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
Propentofylline抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，表現(xiàn)為濃度依賴性抑制，隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)(見(jiàn)圖和表1)。
Table1.The effect of propentofylline on hydrogen
proxide in fMLP-stimulated neutropjils(mean±SD，n=4) Concentration(μmol.L-1)
, http://www.www.srpcoatings.com
0
10
30
100
300
1000
mean±SD
100±9.0
90.2±14.5
81.7±12.5
54.1±18.9
47.7±15.6
24.7±9.3
, http://www.www.srpcoatings.com
Fig1.The effect of propentofylline on hydrogen proxidein fMLP-stimulated neutrophils.
2. Propentofylline 對(duì)腺苷作用的影響
腺苷和NECA均抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。并隨著濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)。低濃度的Propentofylline (1μmol.L-1)不影響腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的作用(數(shù)據(jù)未顯示)，而高濃度的Propentofylline (100μmol.L-1)明顯增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用P<0.05,最大抑制率由66%升到81%。然而，NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用不受Propentofylline 的影響p>0.05(見(jiàn)表2)。
Table2.The effects of adenosine and NEDA on hydrogen proxide production in the presence
, 百拇醫(yī)藥
or absence of propentofylline(mean±SD,n=8) Group
Concentration(μg.L-1)
0
0.01
0.1
1
10
Adenosine
100±7.5
94.2±10.6
80.1±9.1
, http://www.www.srpcoatings.com
45.4±7.7
34.4±5.3
+PPF1000
(μmol.L-1)
92.8±8.9
62.9±7.5*
24.5±4.3*
20.6±3.2
NECA
100±5.4
90.5±7.2
, 百拇醫(yī)藥
67.7±7.4
38.1±4.7
26.6±4.0
+PPF100
(μmol.L-1)
84.7±15.3
63.5±15.2
43.6±7.8
29.8±5.5
討論
組織缺血激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)結(jié)合，引起細(xì)胞膜功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞死亡[4]。缺血也刺激腺苷的產(chǎn)生，現(xiàn)已證實(shí)，腺苷抑制中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞，降低氧自由基釋放。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放腺苷阻止激活白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[5]。然而，由于外源性腺苷對(duì)心血管系統(tǒng)嚴(yán)重的副作用，如低血壓和竇性心動(dòng)過(guò)緩，臨床應(yīng)用受到限制。近年來(lái)研究趨于促進(jìn)內(nèi)源性腺苷的產(chǎn)生或抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，利用內(nèi)源性腺苷發(fā)揮作用。
, http://www.www.srpcoatings.com
與以往的報(bào)道相同，腺苷抑制fMLP激活的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。Propentofylline增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用，但不影響NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。這與腦組織研究結(jié)果類(lèi)似，在那里，Propentofylline 增加腺苷所引起的cAMP水平，卻不影響NECA所引起的cAMP水平，表明Propentofylline發(fā)揮作用在腺苷受體激活以前。因?yàn)镹ECA與腺苷代謝途徑不同, 機(jī)制可能象文獻(xiàn)報(bào)道的那樣，Propentofylline抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷的濃度所致[6]。
腺苷通過(guò)其受體發(fā)揮作用，腺苷A2受體通過(guò)細(xì)胞膜上的Gs蛋白興奮腺苷環(huán)化酶使細(xì)胞內(nèi)的ATP變成cAMP, cAMP在磷酸二酯酶的作用下形成5誂MP。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，cAMP通過(guò)蛋白激酶A，使細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。Propentofylline也是磷酸二酯酶抑制劑[7]，可以推測(cè)Propentofylline可能通過(guò)增加cAMP濃度增加腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。
, 百拇醫(yī)藥
結(jié)論：Propentofylline抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，可能的機(jī)制通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷的水平，發(fā)揮腺苷的作用。這也可能是它保護(hù)心腦組織缺血性損傷的機(jī)制之一。
參考文獻(xiàn)
1.Hofmann W,Gojowczy KG and Stefanovich V. Effects of a xanthine derivative, propentofylline, on local cerebral blood flow and glucose utilization in the rat. Brain Res, 1996; 740:41～46.
2.Wright DG. Human neutrophils degranulation. Methods Enzymol,1988; 162: 538～543.
, 百拇醫(yī)藥
3. Wymann MP, von Tscharner V, Deranleau DA et al.Chemiluminescence detection of H2O2 produced by human neutrophils during the respiratory burst. Anal Biochem, 1987; 165: 371～378.
4.Ambrosio G and Chiariello M. .Myocardial reperfusion injury:mechanisms and management. A review. Am J Med, 1991; 91(Suppl3c):86～95.
5.Zhang Y, Polmblad J and Fredholm BB. Biphasic effect of ATP on neutrophil functions mediated by P2u and adenosine A2a receptors.Biochemical Pharmacology, 1996; 51: 957～965.
, 百拇醫(yī)藥
6.Parkinson FE, Rudolphi KA, Fredholm BB. Propentofylline: a nucleoside transport inhibitor with neuroprotective effects in cerebral ischemia. Gen-Pharmacol, 1994; 25: 1053～1058.
7.Fredholm BB and Lindtrom K. The xanthine derivative 1-(5'-oxohexxyl)-3-methy-7-propy) xanthine (HWA 285) enhances the action of adenosine.Acta Pharmacol Toxicol, 1986; 58: 187～192.
收稿：1999-4-6
修回：1999-11-5, 百拇醫(yī)藥
單位：白求恩醫(yī)科大學(xué)，長(zhǎng)春 130021
關(guān)鍵詞：腺苷；Propentofylline；過(guò)氧化氫
中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志000115
摘 要：本研究探討Propentofylline對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其它的作用機(jī)制。采用魯米諾依賴的全血化學(xué)發(fā)光法測(cè)定fMLP激活的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。結(jié)果顯示Propentofylline以濃度依賴形式抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，并增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用，但不影響NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果提示，Propentofylline通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷水平，增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。這種作用也可能是Propentofylline保護(hù)心腦組織損傷的機(jī)制之一。
The Effects of Propentofylline on Human Neutrophils
, http://www.www.srpcoatings.com
ZHANG Yu BA Tu
(Norman Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130021)
Abstract：In this study, we tested the effects and mechanisms of propentofylline on human neutrophils. The neutrophils were stimulated by fMLP (formyl-MetLeuPhe) and hydrogen peroxide was determined by the luminol amplified chemiluminescence. Results showned that propentofylline inhibited the hydrogen peroxide production by neutrophils in concentration-dependent manner. The inhibitory effect of adenosine on fMLP-stimulated neutrophil hydrogen peroxide was markedly increased in the presence of propentofylline. But that of NECA (5`-N-ethylcarboxamidoadenosine) was unaffected, indicated that the inhibitory effect of propentofylline on neutrophils was mediated by inhibiting adenosine uptake and increasing the local concentration of adenosine. This effect could be a mechanism of the protective effects of propentofylline on the ischemia of brain and heart.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：adenosine;propentofylline;hydrogen peroxide
Propentofylline，是新的黃嘌呤衍生物，已經(jīng)顯示對(duì)心腦組織缺血具有保護(hù)作用，機(jī)制可能與其擴(kuò)張血管，增加能量恢復(fù)及降低腦組織水腫有關(guān)[1]。由于中性粒細(xì)胞在組織缺血再灌注損傷中起著重要的作用，因此，我們研究了Propentofylline 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用及其它的作用機(jī)制。用甲酰基-甲硫氨基-亮氨�；�-苯丙氨酸(fMLP)激活中性粒細(xì)胞，采用魯米諾反應(yīng)測(cè)量中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的過(guò)氧化氫含量。
材料和方法
1.試劑
腺苷或其衍生物N-已基-羧酰氨基腺苷(NECA)的濃度為0.01, 0.1, 1, 10 μmol.L-1。 Propentofylline的濃度為10, 30, 100, 300, 1000μmol.L-1。Hank 平衡鹽溶液。細(xì)胞激化劑(fMLP)1μmol.L-1。
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2. 測(cè)定方法
2.1 中性粒細(xì)胞的分離
取健康成年人血30～50 ml,肝素抗凝, 用Percoll細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，參照Wright法[2]進(jìn)行，離心后收集中性粒細(xì)胞，用PBS沖洗二次，蒸溜水溶解污染的紅細(xì)胞。沖洗后的細(xì)胞再用Hank 平衡鹽溶液配成理想的濃度1×106/ml，計(jì)數(shù)所得細(xì)胞，以中性粒細(xì)胞比例>90%(革蘭染色)及細(xì)胞活力>95%(臺(tái)盼藍(lán)拒染)為合格。
2.2 過(guò)氧化氫的測(cè)定
采用魯米諾依賴的全血化學(xué)發(fā)光法(CL) 參照Wymann法[3]進(jìn)行，這是測(cè)定中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)非常敏感的方法。不同濃度的藥物加到含中性粒細(xì)胞的試管中，在37°C條件下水浴5 min后，fMLP激活細(xì)胞，細(xì)胞釋放的CL用Luminometer測(cè)定。CL峰值代表中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫的量。數(shù)據(jù)表達(dá)采用與對(duì)照組的百分比。所有藥物在無(wú)細(xì)胞情況下均不影響魯米諾系統(tǒng)。
, 百拇醫(yī)藥
2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有數(shù)據(jù)均為平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，來(lái)源于4～8個(gè)試驗(yàn)。顯著性差異用t檢驗(yàn)方法測(cè)定。
結(jié)果
1. Propentofylline 對(duì)中性粒細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用
Propentofylline抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，表現(xiàn)為濃度依賴性抑制，隨著濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)(見(jiàn)圖和表1)。
Table1.The effect of propentofylline on hydrogen
proxide in fMLP-stimulated neutropjils(mean±SD，n=4) Concentration(μmol.L-1)
, http://www.www.srpcoatings.com
0
10
30
100
300
1000
mean±SD
100±9.0
90.2±14.5
81.7±12.5
54.1±18.9
47.7±15.6
24.7±9.3
, http://www.www.srpcoatings.com
Fig1.The effect of propentofylline on hydrogen proxidein fMLP-stimulated neutrophils.
2. Propentofylline 對(duì)腺苷作用的影響
腺苷和NECA均抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。并隨著濃度的增加其抑制作用增強(qiáng)。低濃度的Propentofylline (1μmol.L-1)不影響腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的作用(數(shù)據(jù)未顯示)，而高濃度的Propentofylline (100μmol.L-1)明顯增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用P<0.05,最大抑制率由66%升到81%。然而，NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用不受Propentofylline 的影響p>0.05(見(jiàn)表2)。
Table2.The effects of adenosine and NEDA on hydrogen proxide production in the presence
, 百拇醫(yī)藥
or absence of propentofylline(mean±SD,n=8) Group
Concentration(μg.L-1)
0
0.01
0.1
1
10
Adenosine
100±7.5
94.2±10.6
80.1±9.1
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45.4±7.7
34.4±5.3
+PPF1000
(μmol.L-1)
92.8±8.9
62.9±7.5*
24.5±4.3*
20.6±3.2
NECA
100±5.4
90.5±7.2
, 百拇醫(yī)藥
67.7±7.4
38.1±4.7
26.6±4.0
+PPF100
(μmol.L-1)
84.7±15.3
63.5±15.2
43.6±7.8
29.8±5.5
討論
組織缺血激活中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量氧自由基，與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)結(jié)合，引起細(xì)胞膜功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，細(xì)胞死亡[4]。缺血也刺激腺苷的產(chǎn)生，現(xiàn)已證實(shí)，腺苷抑制中性粒細(xì)胞粘附到內(nèi)皮細(xì)胞，降低氧自由基釋放。血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)釋放腺苷阻止激活白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[5]。然而，由于外源性腺苷對(duì)心血管系統(tǒng)嚴(yán)重的副作用，如低血壓和竇性心動(dòng)過(guò)緩，臨床應(yīng)用受到限制。近年來(lái)研究趨于促進(jìn)內(nèi)源性腺苷的產(chǎn)生或抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，利用內(nèi)源性腺苷發(fā)揮作用。
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與以往的報(bào)道相同，腺苷抑制fMLP激活的中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫。Propentofylline增強(qiáng)腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用，但不影響NECA對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。這與腦組織研究結(jié)果類(lèi)似，在那里，Propentofylline 增加腺苷所引起的cAMP水平，卻不影響NECA所引起的cAMP水平，表明Propentofylline發(fā)揮作用在腺苷受體激活以前。因?yàn)镹ECA與腺苷代謝途徑不同, 機(jī)制可能象文獻(xiàn)報(bào)道的那樣，Propentofylline抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷的濃度所致[6]。
腺苷通過(guò)其受體發(fā)揮作用，腺苷A2受體通過(guò)細(xì)胞膜上的Gs蛋白興奮腺苷環(huán)化酶使細(xì)胞內(nèi)的ATP變成cAMP, cAMP在磷酸二酯酶的作用下形成5誂MP。cAMP是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，cAMP通過(guò)蛋白激酶A，使細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。Propentofylline也是磷酸二酯酶抑制劑[7]，可以推測(cè)Propentofylline可能通過(guò)增加cAMP濃度增加腺苷對(duì)中性粒細(xì)胞的抑制作用。
, 百拇醫(yī)藥
結(jié)論：Propentofylline抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)氧化氫，可能的機(jī)制通過(guò)抑制細(xì)胞對(duì)腺苷的攝取，增加局部腺苷的水平，發(fā)揮腺苷的作用。這也可能是它保護(hù)心腦組織缺血性損傷的機(jī)制之一。
參考文獻(xiàn)
1.Hofmann W,Gojowczy KG and Stefanovich V. Effects of a xanthine derivative, propentofylline, on local cerebral blood flow and glucose utilization in the rat. Brain Res, 1996; 740:41～46.
2.Wright DG. Human neutrophils degranulation. Methods Enzymol,1988; 162: 538～543.
, 百拇醫(yī)藥
3. Wymann MP, von Tscharner V, Deranleau DA et al.Chemiluminescence detection of H2O2 produced by human neutrophils during the respiratory burst. Anal Biochem, 1987; 165: 371～378.
4.Ambrosio G and Chiariello M. .Myocardial reperfusion injury:mechanisms and management. A review. Am J Med, 1991; 91(Suppl3c):86～95.
5.Zhang Y, Polmblad J and Fredholm BB. Biphasic effect of ATP on neutrophil functions mediated by P2u and adenosine A2a receptors.Biochemical Pharmacology, 1996; 51: 957～965.
, 百拇醫(yī)藥
6.Parkinson FE, Rudolphi KA, Fredholm BB. Propentofylline: a nucleoside transport inhibitor with neuroprotective effects in cerebral ischemia. Gen-Pharmacol, 1994; 25: 1053～1058.
7.Fredholm BB and Lindtrom K. The xanthine derivative 1-(5'-oxohexxyl)-3-methy-7-propy) xanthine (HWA 285) enhances the action of adenosine.Acta Pharmacol Toxicol, 1986; 58: 187～192.
收稿：1999-4-6
修回：1999-11-5, 百拇醫(yī)藥