微小按蚊種團(tuán)酯酶同工酶比較研究
作者：王學(xué)忠 李菊升 王丕玉
單位：王學(xué)忠(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)；李菊升(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)；王丕玉(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)
關(guān)鍵詞：微小按蚊；烏頭按蚊；溪流按蚊；酯酶同工酶；電泳
實用寄生蟲病雜志000103 摘要 應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)比較分析了3種(微小按蚊、烏頭按蚊、溪流按蚊)雌按蚊酯酶(EST)酶譜，EST出現(xiàn)兩組區(qū)帶，微小按蚊(含2個不同地株)存在遺傳上的多態(tài)現(xiàn)象，烏頭按蚊EST酯酶相對簡單。各自均有穩(wěn)定的酶帶，并可根據(jù)Rm值結(jié)合各自特殊酶帶區(qū)分成3個不同的種。
中圖分類號：R384.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1005-2534(2000)01-0009-03
, 百拇醫(yī)藥
COMPARISON OF ESTERASE ISOENZYME OF
ANOPHELES MINIMUS GROUP IN YUNNAN
Wang Xuezhong
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
Li Jusheng
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
Wang Peiyu
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
, 百拇醫(yī)藥
ABSTRACT Esterase enzymograms of femal An.minimus, An.aconitus and An. fluviatilis have been compared and analysed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results showed that esterase enzymogram of each species revealed stable and respective two band groups. There were genetic polymorphism in both two geographic strains of An. minimus while it was relatively simple in An.aconitus. In addition, the three species could be differentiated by respective band and Rm value.
, http://www.www.srpcoatings.com
Key words：An. minimus; An.aconitus; An.fluviatilis; esterase isoenzyme; electrophoresis
微小按蚊(Anopheles[cellia]minimus Theabald 1901)廣泛分布于我國南方山區(qū)，是云南省北緯25°以南地區(qū)的主要傳瘧媒介[1]。最近研究認(rèn)為，微小按蚊是一個復(fù)合體，含A、B、C三型，A、C型分布于泰國，B型分布于中國南部[2]。作者以往的研究證明不同地株染色體存在差異，特別是性染色體上出現(xiàn)了不同的著絲粒，對間日瘧原蟲敏感性也存在一定的差異[1]。烏頭按蚊被認(rèn)為是東南亞的傳瘧媒介，溪流按蚊幼蟲與微小按蚊差別無異，僅靠成蚊作為區(qū)別，而且也被認(rèn)為是我國南方的傳瘧媒介。對3者比較，確定其EST同工酶酶譜以資鑒別。本研究旨在擴(kuò)大地區(qū)范圍對各群體間等位基因遺傳情況和分化程度作進(jìn)一步探討。
1 材料和方法
, 百拇醫(yī)藥
1.1 蚊蟲來源
微小按蚊采自臨滄，烏頭按蚊和溪流按蚊采自思茅，自然群體帶回實驗室進(jìn)行馴化。廣西株微小按蚊由廣西醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室惠贈。實驗室室溫26℃±1℃，相對濕度75%～80%，光照(40W日光燈)12h/d。
1.2 蚊蟲勻漿的制備
將化蛹6～8h和羽化24～36h雌蚊，取單管培養(yǎng)的單只蟲體，群體管取2～5只蚊蟲加50μl緩沖液(0.2mol/L Tris 25ml,0.1N HCl 45ml,Triton X-100 0.5ml，雙蒸水29.5ml)，50μl 50%蔗糖，在微型勻漿器內(nèi)冰浴磨碎，3 500r/min離心。電泳時把每次離心出的全部上清液加入凝膠槽內(nèi)。
1.3 電泳
采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。制備7.5%分離膠 pH8.9和2.5%濃縮膠 pH6.7，Tris-甘氨酸系統(tǒng)。電壓：濃縮膠為240V，分離膠為360V，在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行，以溴酚藍(lán)為指示劑，當(dāng)指示劑到達(dá)邊緣時停止電泳。電泳時間約2h，在BIO-RAD3000型恒壓穩(wěn)流電泳儀中進(jìn)行。
, 百拇醫(yī)藥
1.4 染色
取40mg醋酸-α-萘酯，用4ml丙酮溶解，染色前加入pH6.4磷酸緩沖液40ml,40mg堅牢蘭RR(Fast blue RR)，把凝膠放入盛有染色液的培養(yǎng)皿中，于37℃水浴15min,用7%醋酸漂洗脫色，制成干膠片或浸于該液中保存。
2 結(jié)果
兩地株微小按蚊與烏頭按蚊比較，EST同工酶酶譜，微小按蚊不論單母系子代和群體均顯示出Ⅰ、Ⅱ兩組區(qū)帶，烏頭按蚊Ⅰ區(qū)帶不明顯，Ⅱ區(qū)帶顯示明顯，溪流按蚊和烏頭按蚊一樣Ⅰ區(qū)帶不清、Ⅱ區(qū)帶較明顯。近負(fù)極Ⅰ區(qū)帶全部為淡染，證明酯酶活性較弱，靠近正極Ⅱ區(qū)帶而以深染帶為主，酯酶活性較強(qiáng)，兩地株微小按蚊Rm值(Relative mobility)均存在著明顯的差異，烏頭按蚊與微小按蚊Rm值存在著明顯的差異，足以區(qū)別兩種按蚊分別為各自獨立的種。
臨滄株與廣西株的Rm值存在著差異，但二者均未大于1.00。臨滄株成蚊分別為：0.18、0.26、0.49、0.58、0.64、0.71、0.90、1.00；蛹分別為：0.21、0.26、0.62、0.67、0.71、0.75、0.78、0.88、0.92、0.98。廣西株成蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，蛹的Ⅰ區(qū)帶出現(xiàn)一條和其他地株不同單一的條區(qū)帶，其成蚊分別為：0.62、0.63、0.65、0.71、0.90、1.00；蛹為：0.26、0.62、0.66、0.82、0.90、1.00。烏頭按蚊Ⅰ區(qū)帶不出現(xiàn)，而Ⅱ區(qū)帶僅有1條0.80的帶。溪流按蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，Ⅱ區(qū)帶分別為0.63、0.68、0.75、0.80條帶(圖1)。
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圖1.微小按蚊種團(tuán)酯酶同工酶比較
1，2.廣西微小按蚊成蚊，蛹，3，4.臨滄微小按蚊成蚊，蛹，5.烏頭按蚊，6.溪流按蚊。
3 討論
微小按蚊種型特征的研究，仍應(yīng)用經(jīng)典的形態(tài)分類結(jié)合電鏡掃描和用染色體、同工酶酶譜和DNA遺傳分類兩大類型。最近的研究證明微小按蚊是一個復(fù)合體，A型分布于整個泰國，B型分布于中國南部，C型僅分布于泰國西部。Sucharit.S用成蟲和卵形態(tài)特征結(jié)合電鏡證明，C型成蚊翅前緣脈具分脈前白斑(PSP)和肩白斑(HP)，卵船表面不完整和緣飾不規(guī)則。作者根據(jù)以往的研究表明，云南西部微小按蚊卵也有船面不完整，但數(shù)量極少(6/350)占1.71%，認(rèn)為是變異引起。對云南微小按蚊隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA及遺傳分化關(guān)系的研究表明，從遺傳距離指數(shù)構(gòu)建分子聚類樹可見，受試的29只微小按蚊可歸并5個顯著不同的組，對應(yīng)于5個樣品源的5個地株。云南微小按蚊的地理群體間基因流程度不高，存在著遺傳分化[3]。本文報道的兩個地株微小按蚊Est Ⅱ雖不盡相同，但也有相似的酶譜帶型。臨滄株成蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，而蛹Ⅰ區(qū)帶顯帶較清晰。各自的Rm值都相對穩(wěn)定，其中以Est[-71]，Est[-80]Est[-88]占優(yōu)勢，而且出現(xiàn)頻率較高。由此可見兩地株Est同工酶存在多態(tài)性，遺傳一致性(Ⅰ)并不一致，臨滄株Ⅰ=0.85、廣西Ⅰ=0.95。同時再一次證明了微小按蚊各群體間已出現(xiàn)了分化現(xiàn)象，但其分化程度未超出種和亞種的分子水平，而且各群體間有鮮明的地域性，形成了獨立的地理品質(zhì)。各群體間對間日瘧原蟲敏感性上存在一定的差異(最高的83.3%鎮(zhèn)定，最低為44.8%元陽，(P<0.01)[1]。以往自然感染調(diào)查，各群體間的感染率也不盡相同(思茅0.21%、景洪0.78%、潞西1.2%、廣西0.11%)，由于不同地理群體間遺傳上的相對獨立性導(dǎo)致不同地域的瘧疾流行強(qiáng)度，作者認(rèn)為，目前要有效控制微小按蚊，首先應(yīng)因地制宜，根據(jù)各地的實際情況制定出一整套行之有效的技術(shù)方案，才能取得事半功倍的成果。
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微小按蚊種團(tuán)成員間的形態(tài)分類，由于形態(tài)上的差異較小，給分類帶來了許多困難。微小按蚊與溪流按蚊近似，二者雜交可以產(chǎn)生健壯的子代，各蟲期的發(fā)育和生長正常，子代形態(tài)也無固定的母體特征，這表明兩者在形態(tài)及其遺傳性上無明顯區(qū)別特征。許錦江等認(rèn)為翅前緣脈上分脈前白斑的有無和分脈白斑與分脈暗斑比例的大小，是鑒別二者的重要依據(jù)[7]。烏頭按蚊與上述的微小按蚊和溪流按蚊形態(tài)比較近似，加上多個體變異，鑒別時也出現(xiàn)困難。本研究用酯酶同工酶可以根據(jù)酶譜帶型和各自相對穩(wěn)定的Rm值區(qū)分三個不同的種，但仍需應(yīng)用分子生物學(xué)手段加以證實。
參考文獻(xiàn)
1，王學(xué)忠，王丕玉，李菊升.云南微小按蚊(Anopheles minimus)種型和間日瘧原蟲感染性初步研究〔J〕.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，1995；2(4)∶223
2，王學(xué)忠，李菊升，王丕玉.云南不同地株微小按蚊酯酶同工酶比較研究〔J〕.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，1996；7(5)∶321
, http://www.www.srpcoatings.com
3，陳永久，王學(xué)忠，王丕玉，等.云南微小按蚊隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA及遺傳分化關(guān)系〔J〕.動物學(xué)研究，1998；19(3)∶184
4，葉奕英，許政拱，黃若密，等.廣西和云南兩地微小按蚊的雜交試驗〔J〕.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1992；10(4)∶287
5，Sucharit S,Kowalamisar N,Leemingsawat S et al.Population genetic studies on the Anopheles minimus complex in Thailand〔J〕.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth，1988；19(4)∶717
6，Sucharit S,et al.New evidence for the differed character of Anopheles minimus species complex〔J〕.Mosquito-Borne Dis Bull，1995；12(1)∶1
7，許錦江，羅幸福，湯林華.微小按蚊和溪流按蚊翅斑形態(tài)的比較〔J〕.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1998；16(2)∶89
8，周祖杰.中國瘧疾的防治研究〔M〕，北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：122
9，董學(xué)書.云南蚊類志〔M〕.上卷(按蚊亞科).昆明：云南科技出版社，1993：170, http://www.www.srpcoatings.com
單位：王學(xué)忠(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)；李菊升(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)；王丕玉(云南省瘧疾防治研究所，思茅 665000)
關(guān)鍵詞：微小按蚊；烏頭按蚊；溪流按蚊；酯酶同工酶；電泳
實用寄生蟲病雜志000103 摘要 應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)技術(shù)比較分析了3種(微小按蚊、烏頭按蚊、溪流按蚊)雌按蚊酯酶(EST)酶譜，EST出現(xiàn)兩組區(qū)帶，微小按蚊(含2個不同地株)存在遺傳上的多態(tài)現(xiàn)象，烏頭按蚊EST酯酶相對簡單。各自均有穩(wěn)定的酶帶，并可根據(jù)Rm值結(jié)合各自特殊酶帶區(qū)分成3個不同的種。
中圖分類號：R384.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A
文章編號：1005-2534(2000)01-0009-03
, 百拇醫(yī)藥
COMPARISON OF ESTERASE ISOENZYME OF
ANOPHELES MINIMUS GROUP IN YUNNAN
Wang Xuezhong
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
Li Jusheng
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
Wang Peiyu
(Yunnan Institute of Malaria Control, Simao 665000)
, 百拇醫(yī)藥
ABSTRACT Esterase enzymograms of femal An.minimus, An.aconitus and An. fluviatilis have been compared and analysed by polyacrylamide gel electrophoresis. The results showed that esterase enzymogram of each species revealed stable and respective two band groups. There were genetic polymorphism in both two geographic strains of An. minimus while it was relatively simple in An.aconitus. In addition, the three species could be differentiated by respective band and Rm value.
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Key words：An. minimus; An.aconitus; An.fluviatilis; esterase isoenzyme; electrophoresis
微小按蚊(Anopheles[cellia]minimus Theabald 1901)廣泛分布于我國南方山區(qū)，是云南省北緯25°以南地區(qū)的主要傳瘧媒介[1]。最近研究認(rèn)為，微小按蚊是一個復(fù)合體，含A、B、C三型，A、C型分布于泰國，B型分布于中國南部[2]。作者以往的研究證明不同地株染色體存在差異，特別是性染色體上出現(xiàn)了不同的著絲粒，對間日瘧原蟲敏感性也存在一定的差異[1]。烏頭按蚊被認(rèn)為是東南亞的傳瘧媒介，溪流按蚊幼蟲與微小按蚊差別無異，僅靠成蚊作為區(qū)別，而且也被認(rèn)為是我國南方的傳瘧媒介。對3者比較，確定其EST同工酶酶譜以資鑒別。本研究旨在擴(kuò)大地區(qū)范圍對各群體間等位基因遺傳情況和分化程度作進(jìn)一步探討。
1 材料和方法
, 百拇醫(yī)藥
1.1 蚊蟲來源
微小按蚊采自臨滄，烏頭按蚊和溪流按蚊采自思茅，自然群體帶回實驗室進(jìn)行馴化。廣西株微小按蚊由廣西醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室惠贈。實驗室室溫26℃±1℃，相對濕度75%～80%，光照(40W日光燈)12h/d。
1.2 蚊蟲勻漿的制備
將化蛹6～8h和羽化24～36h雌蚊，取單管培養(yǎng)的單只蟲體，群體管取2～5只蚊蟲加50μl緩沖液(0.2mol/L Tris 25ml,0.1N HCl 45ml,Triton X-100 0.5ml，雙蒸水29.5ml)，50μl 50%蔗糖，在微型勻漿器內(nèi)冰浴磨碎，3 500r/min離心。電泳時把每次離心出的全部上清液加入凝膠槽內(nèi)。
1.3 電泳
采用垂直平板聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)文獻(xiàn)[2]方法進(jìn)行。制備7.5%分離膠 pH8.9和2.5%濃縮膠 pH6.7，Tris-甘氨酸系統(tǒng)。電壓：濃縮膠為240V，分離膠為360V，在4℃冰箱內(nèi)進(jìn)行，以溴酚藍(lán)為指示劑，當(dāng)指示劑到達(dá)邊緣時停止電泳。電泳時間約2h，在BIO-RAD3000型恒壓穩(wěn)流電泳儀中進(jìn)行。
, 百拇醫(yī)藥
1.4 染色
取40mg醋酸-α-萘酯，用4ml丙酮溶解，染色前加入pH6.4磷酸緩沖液40ml,40mg堅牢蘭RR(Fast blue RR)，把凝膠放入盛有染色液的培養(yǎng)皿中，于37℃水浴15min,用7%醋酸漂洗脫色，制成干膠片或浸于該液中保存。
2 結(jié)果
兩地株微小按蚊與烏頭按蚊比較，EST同工酶酶譜，微小按蚊不論單母系子代和群體均顯示出Ⅰ、Ⅱ兩組區(qū)帶，烏頭按蚊Ⅰ區(qū)帶不明顯，Ⅱ區(qū)帶顯示明顯，溪流按蚊和烏頭按蚊一樣Ⅰ區(qū)帶不清、Ⅱ區(qū)帶較明顯。近負(fù)極Ⅰ區(qū)帶全部為淡染，證明酯酶活性較弱，靠近正極Ⅱ區(qū)帶而以深染帶為主，酯酶活性較強(qiáng)，兩地株微小按蚊Rm值(Relative mobility)均存在著明顯的差異，烏頭按蚊與微小按蚊Rm值存在著明顯的差異，足以區(qū)別兩種按蚊分別為各自獨立的種。
臨滄株與廣西株的Rm值存在著差異，但二者均未大于1.00。臨滄株成蚊分別為：0.18、0.26、0.49、0.58、0.64、0.71、0.90、1.00；蛹分別為：0.21、0.26、0.62、0.67、0.71、0.75、0.78、0.88、0.92、0.98。廣西株成蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，蛹的Ⅰ區(qū)帶出現(xiàn)一條和其他地株不同單一的條區(qū)帶，其成蚊分別為：0.62、0.63、0.65、0.71、0.90、1.00；蛹為：0.26、0.62、0.66、0.82、0.90、1.00。烏頭按蚊Ⅰ區(qū)帶不出現(xiàn)，而Ⅱ區(qū)帶僅有1條0.80的帶。溪流按蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，Ⅱ區(qū)帶分別為0.63、0.68、0.75、0.80條帶(圖1)。
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圖1.微小按蚊種團(tuán)酯酶同工酶比較
1，2.廣西微小按蚊成蚊，蛹，3，4.臨滄微小按蚊成蚊，蛹，5.烏頭按蚊，6.溪流按蚊。
3 討論
微小按蚊種型特征的研究，仍應(yīng)用經(jīng)典的形態(tài)分類結(jié)合電鏡掃描和用染色體、同工酶酶譜和DNA遺傳分類兩大類型。最近的研究證明微小按蚊是一個復(fù)合體，A型分布于整個泰國，B型分布于中國南部，C型僅分布于泰國西部。Sucharit.S用成蟲和卵形態(tài)特征結(jié)合電鏡證明，C型成蚊翅前緣脈具分脈前白斑(PSP)和肩白斑(HP)，卵船表面不完整和緣飾不規(guī)則。作者根據(jù)以往的研究表明，云南西部微小按蚊卵也有船面不完整，但數(shù)量極少(6/350)占1.71%，認(rèn)為是變異引起。對云南微小按蚊隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA及遺傳分化關(guān)系的研究表明，從遺傳距離指數(shù)構(gòu)建分子聚類樹可見，受試的29只微小按蚊可歸并5個顯著不同的組，對應(yīng)于5個樣品源的5個地株。云南微小按蚊的地理群體間基因流程度不高，存在著遺傳分化[3]。本文報道的兩個地株微小按蚊Est Ⅱ雖不盡相同，但也有相似的酶譜帶型。臨滄株成蚊Ⅰ區(qū)帶顯帶不清，而蛹Ⅰ區(qū)帶顯帶較清晰。各自的Rm值都相對穩(wěn)定，其中以Est[-71]，Est[-80]Est[-88]占優(yōu)勢，而且出現(xiàn)頻率較高。由此可見兩地株Est同工酶存在多態(tài)性，遺傳一致性(Ⅰ)并不一致，臨滄株Ⅰ=0.85、廣西Ⅰ=0.95。同時再一次證明了微小按蚊各群體間已出現(xiàn)了分化現(xiàn)象，但其分化程度未超出種和亞種的分子水平，而且各群體間有鮮明的地域性，形成了獨立的地理品質(zhì)。各群體間對間日瘧原蟲敏感性上存在一定的差異(最高的83.3%鎮(zhèn)定，最低為44.8%元陽，(P<0.01)[1]。以往自然感染調(diào)查，各群體間的感染率也不盡相同(思茅0.21%、景洪0.78%、潞西1.2%、廣西0.11%)，由于不同地理群體間遺傳上的相對獨立性導(dǎo)致不同地域的瘧疾流行強(qiáng)度，作者認(rèn)為，目前要有效控制微小按蚊，首先應(yīng)因地制宜，根據(jù)各地的實際情況制定出一整套行之有效的技術(shù)方案，才能取得事半功倍的成果。
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微小按蚊種團(tuán)成員間的形態(tài)分類，由于形態(tài)上的差異較小，給分類帶來了許多困難。微小按蚊與溪流按蚊近似，二者雜交可以產(chǎn)生健壯的子代，各蟲期的發(fā)育和生長正常，子代形態(tài)也無固定的母體特征，這表明兩者在形態(tài)及其遺傳性上無明顯區(qū)別特征。許錦江等認(rèn)為翅前緣脈上分脈前白斑的有無和分脈白斑與分脈暗斑比例的大小，是鑒別二者的重要依據(jù)[7]。烏頭按蚊與上述的微小按蚊和溪流按蚊形態(tài)比較近似，加上多個體變異，鑒別時也出現(xiàn)困難。本研究用酯酶同工酶可以根據(jù)酶譜帶型和各自相對穩(wěn)定的Rm值區(qū)分三個不同的種，但仍需應(yīng)用分子生物學(xué)手段加以證實。
參考文獻(xiàn)
1，王學(xué)忠，王丕玉，李菊升.云南微小按蚊(Anopheles minimus)種型和間日瘧原蟲感染性初步研究〔J〕.寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報，1995；2(4)∶223
2，王學(xué)忠，李菊升，王丕玉.云南不同地株微小按蚊酯酶同工酶比較研究〔J〕.中國媒介生物學(xué)及控制雜志，1996；7(5)∶321
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3，陳永久，王學(xué)忠，王丕玉，等.云南微小按蚊隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA及遺傳分化關(guān)系〔J〕.動物學(xué)研究，1998；19(3)∶184
4，葉奕英，許政拱，黃若密，等.廣西和云南兩地微小按蚊的雜交試驗〔J〕.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1992；10(4)∶287
5，Sucharit S,Kowalamisar N,Leemingsawat S et al.Population genetic studies on the Anopheles minimus complex in Thailand〔J〕.Southeast Asian J Trop Med Pub Hlth，1988；19(4)∶717
6，Sucharit S,et al.New evidence for the differed character of Anopheles minimus species complex〔J〕.Mosquito-Borne Dis Bull，1995；12(1)∶1
7，許錦江，羅幸福，湯林華.微小按蚊和溪流按蚊翅斑形態(tài)的比較〔J〕.中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1998；16(2)∶89
8，周祖杰.中國瘧疾的防治研究〔M〕，北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：122
9，董學(xué)書.云南蚊類志〔M〕.上卷(按蚊亞科).昆明：云南科技出版社，1993：170, http://www.www.srpcoatings.com