苯胺類化合物對(duì)肝細(xì)胞毒性的定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系研究
作者：牛靜萍 趙曉紅
單位：牛靜萍 (蘭州醫(yī)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室 730000)； 趙曉紅 (蘭州大學(xué)生物系博士生)
關(guān)鍵詞：定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)；大鼠游離肝細(xì)胞；拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)；細(xì)胞毒性
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志990108 內(nèi)容摘要 以大鼠游離肝細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)和細(xì)胞逸出酶(SDH和LDH)為觀察指標(biāo)，研究了25種苯胺類化合物的肝細(xì)胞毒性，并利用這些毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)為因變量，以這些化合物的10種拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)為自變量，利用多元逐步回歸統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行了定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)的深入探討。結(jié)果表明，化合物的結(jié)構(gòu)不同則毒性不同，3個(gè)QSAR方程中影響毒性的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)有分子連接性指數(shù)0xv、1xv,2xv、3xvc和分子負(fù)熵I。實(shí)驗(yàn)得出的3個(gè)QSAR方程能夠較好地預(yù)測(cè)苯胺類化合物的毒性。
, 百拇醫(yī)藥
Cytotoxicity and quantitative structure-activity relationships (QSAR) of aminobenzene derivatives to rat hepatocytes
Niu Jing-ping
(Lan zhou Medical College，730000)
Zhao Xiao-hong
This study investigated toxicity of 25 aminobenzene derivatives with cellular median toxic concentration(TC50) of isolated rat hepatocytes and enzymes(SDH and LDH) leaked from hepatocytes.These toxic data(TC50,SDH and LDH) were used as dependent variable and 10 topological indices of 25 aminobenzene derivatives were used as independent variable.QSAR was analyzed with multiple stepwise linear regression.The results indicated that there is different toxicity with different structure of compounds.The principal structure parameters in three QSAR equations to affect hepa-to toxicity were molecular connectivity indices(0XV，1XV，2XV，3XVC) and molecular negentropy(Ⅰ).Three equations obtained in this paper could predict the toxicity of aminobenzene derivatives.
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Key words:quantitative structure-activity relationships(QSAR);isolated rat hepatocytes;topological indices; cytotoxicity.
隨著科學(xué)技術(shù)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高速發(fā)展，定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)是根據(jù)有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，以一定的數(shù)學(xué)模式，定量地描述它們之間的關(guān)系，其目的是預(yù)測(cè)有機(jī)化合物的生物活性。苯胺類化合物在化學(xué)、國(guó)防、醫(yī)藥等工業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用，近年來新合成的此類化合物不斷增加，仍有許多尚未進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
本研究采用大鼠游離肝細(xì)胞，以化合物對(duì)肝細(xì)胞毒性的3項(xiàng)指標(biāo)(TC50、LDH、SDH)作為因變量，以反應(yīng)分子結(jié)構(gòu)特征的分子連接性指數(shù)和分子負(fù)熵作為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，以獲得結(jié)構(gòu)-活性“最優(yōu)”數(shù)學(xué)模式，并用模式預(yù)測(cè)了3種苯胺類同系物對(duì)肝細(xì)胞的毒性。
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材料與方法
1.受試物：受試物為25種苯胺類化合物(表1)。受試物均用二甲基亞砜溶解，pH調(diào)至7.2～7.4，配制5種不同濃度的母液備用。
表1 28種苯胺類化合物、結(jié)構(gòu)式、規(guī)格 編號(hào)
化合物
結(jié)構(gòu)式
規(guī)格
編號(hào)
化合物
結(jié)構(gòu)式
規(guī)格
1
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苯 胺
A.P.
11
2,6-二氯苯胺
L.P.
2
鄰甲苯胺
A.P.
12
間溴苯胺
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C.P.
3
間甲苯胺
C.P.
13
鄰硝基苯胺
C.P.
4
對(duì)甲苯胺
A.P.
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14
間硝基苯胺
C.P.
5
N，N-二甲基苯胺
C.P.
15
對(duì)硝基苯胺
C.P.
, 百拇醫(yī)藥 6
N-乙苯胺
A.P.
16
2,4-二硝基苯胺
A.P.
7
N,N-二甲基
-1,4-苯二胺
, 百拇醫(yī)藥 A.P.
17
4-氯-2-硝基
苯胺
L.P.
8
N,N-二乙基
-1,4-苯二胺
C.P.
18
間-硝基二甲
, 百拇醫(yī)藥
基苯胺
E.P.
9
對(duì)苯二胺
L.R.
19
2,4-二硝基二苯胺
C.P.
10
, 百拇醫(yī)藥 鄰氯苯胺
C.P.
20
對(duì)-亞硝基二甲
基苯胺
C.P.
25
對(duì)氨基苯磺酸
A.R.
21
, 百拇醫(yī)藥
N-亞硝基二苯胺
L.R.
26
1-硝基-2,4-苯二胺
C.P.
22
對(duì)乙氧基苯胺
C.P.
27
, 百拇醫(yī)藥
N-乙酰基-對(duì)
乙氧基苯胺
A.R.
23
4-硝基-2-氨基酚
L.R.
28
2,6-二氯對(duì)硝
基苯胺
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L.R
24
乙�；阴；�
苯胺
C.P.
*用QSAR模式預(yù)測(cè)其毒性的苯胺類同系物
2.動(dòng)物選擇及游離肝細(xì)胞的制備：
選用健康雄性SD大鼠，體重在150～200g，大鼠游離肝細(xì)胞的制備采用黃俊勇[1]等人改進(jìn)的方法，細(xì)胞存活率在90%以上者用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞濃度調(diào)至5×105個(gè)/ml培養(yǎng)液，備用。
3.細(xì)胞毒性觀察指標(biāo)及測(cè)定方法：
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(1)細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)的測(cè)定：將細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.5ml，在測(cè)試組每孔加入10μl備用的受試物，設(shè)5個(gè)不同劑量組和對(duì)照組，染毒后混勻，于飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時(shí)，之后用苔盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率和死亡率，根據(jù)細(xì)胞死亡率用概率單位法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)及其負(fù)對(duì)數(shù)(PTC50)。
(2)細(xì)胞逸出酶活性測(cè)定：用上述25種化合物TC50的1/10濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，于飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，200r/min離心5分，取上清液分別測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)和山梨醇脫氫酶(SDH)活性，并分別計(jì)算各自的負(fù)對(duì)數(shù)。LDH測(cè)定用2,4-二硝基苯肼顯測(cè)法。SDH測(cè)定用間苯二酚顯色法[2]。
4.受試物理論參數(shù)的計(jì)算：
目前，在QSAR研究中，理論參數(shù)有兩部分：理化參數(shù)和拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。我們選用拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，其中有：
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(1)分子連接性指數(shù)(mxvt)：分子連接性指數(shù)是表征分子結(jié)構(gòu)特征的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)中最常用的參數(shù)之一，其計(jì)算公式如下：
[3]
式中nm是價(jià)為m的t類型子圖的數(shù)目，v表示分子結(jié)構(gòu)中含有雜原子，si為第i個(gè)非氫原子的點(diǎn)價(jià)。
(2)分子負(fù)熵：分子負(fù)熵作為一種表征分子結(jié)構(gòu)信息的參數(shù)可將分子影響其生物活性的突出結(jié)構(gòu)特征譯制出來，其計(jì)算公式如下：
[4]
式中N為分子中原子總數(shù)，K為常數(shù)，Pi為某種組合的原子的隨機(jī)選擇機(jī)率。
, 百拇醫(yī)藥
5.QSAR模式的建立：
將TC50、SDH、LDH進(jìn)行負(fù)對(duì)數(shù)變換后，分別作為因變量Y1,Y2,Y3。以苯胺為基本結(jié)構(gòu)計(jì)算出的9種分子連接指數(shù)和分子負(fù)熵作為自變量，進(jìn)行多元逐步回歸分析，以確定最優(yōu)定量結(jié)構(gòu)-活性模式，同時(shí)篩選出與細(xì)胞毒性關(guān)系最為密切的參數(shù)。
結(jié) 果
1.理論參數(shù)計(jì)算及細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果：
25種受試物和3種被預(yù)測(cè)的苯胺同系物的拓樸學(xué)指數(shù)計(jì)算，分別測(cè)定每個(gè)受試物的TC50、SDH和LDH，并計(jì)算各自的負(fù)對(duì)數(shù)Y1,Y2,Y3，結(jié)果列于表2。
表2 28種苯胺類化合物的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)與生物活性 編號(hào)
, 百拇醫(yī)藥
化合物名稱
分子連接性指數(shù)
分子負(fù)熵
I
生物活性
0χv
1χv
(1χv)2
2χv
(2χv)2
, 百拇醫(yī)藥
3χvp
3χvc
4χvp
4χvpc
Y1
Y2
Y3
1
苯胺
, http://www.www.srpcoatings.com
3.964
3.155
9.954
3.736
13.958
2.206
0.913
1.701
1.522
13.035
-3.085
-1.043
-2.210
, http://www.www.srpcoatings.com
2
鄰甲苯胺
4.887
3.533
12.480
4.278
18.301
2.933
1.212
2.043
2.566
18.884
-3.044
, http://www.www.srpcoatings.com
-1.089
-2.273
3
間甲苯胺
4.887
3.521
12.395
4.380
19.185
2.636
1.344
2.236
2.155
, 百拇醫(yī)藥
18.884
-2.469
-1.626
-2.848
4
對(duì)甲苯胺
4.887
3.521
12.395
4.373
19.123
2.706
1.341
, http://www.www.srpcoatings.com
2.003
2.261
16.476
-2.681
-1.462
-2.636
5
N，N-二甲基苯胺
5.834
3.984
15.872
4.518
20.412
, 百拇醫(yī)藥
2.894
1.071
2.222
2.245
18.341
-1.703
-1.848
-3.002
6
N-乙苯胺
5.594
4.177
17.444
, http://www.www.srpcoatings.com
4.199
17.634
2.637
0.874
2.198
1.642
21.579
-2.480
-1.606
-2.837
7
N，N-二甲基-1,4-苯二胺
, 百拇醫(yī)藥 6.334
4.139
17.129
4.789
22.932
3.113
1.288
2.322
2.624
21.252
-1.236
-2.042
-3.147
, http://www.www.srpcoatings.com
8
N，N-二乙基-1，4-苯二胺
7.748
5.291
27.995
5.066
25.670
3.649
1.176
2.919
2.523
29.229
, 百拇醫(yī)藥 -0.788
-2.177
-3.266
9
對(duì)苯二胺
4.464
3.309
10.952
4.007
16.056
2.425
1.129
1.791
, 百拇醫(yī)藥
1.900
10.837
-2.399
-1.637
-2.918
10
鄰氯苯胺
5.091
3.635
13.210
4.439
19.703
3.118
, 百拇醫(yī)藥
1.296
2.150
2.844
15.444
-2.385
-1.660
-2.932
11
2，6-二氯苯胺
6.217
4.108
16.880
5.203
, http://www.www.srpcoatings.com
27.074
3.769
1.771
2.945
3.800
13.035
-2.311
-1.698
-3.006
12
間溴苯胺
5.871
4.013
, 百拇醫(yī)藥
16.102
5.232
27.378
3.248
1.836
2.943
2.921
15.444
-2.081
-1.783
-3.050
13
鄰硝基苯胺
, 百拇醫(yī)藥
5.111
3.737
13.964
4.265
18.194
2.788
1.096
2.188
2.083
18.664
-2.651
-1.478
-2.736
, http://www.www.srpcoatings.com
14
間硝基苯胺
5.111
3.725
13.874
4.322
18.677
2.701
1.178
2.122
2.122
18.664
-2.808
, 百拇醫(yī)藥
-1.380
-2.509
15
對(duì)硝基苯胺
5.111
3.725
13.876
4.315
18.616
2.745
1.175
2.040
2.183
, 百拇醫(yī)藥
16.256
-2.791
-1.412
-2.526
16
2，4-二硝基苯胺
6.259
4.307
18.550
4.851
23.533
3.301
1.377
, 百拇醫(yī)藥
2.522
2.835
21.993
-2.412
-1.609
-2.904
17
4-氯-2-硝基苯胺
6.238
4.205
16.201
5.086
25.866
, 百拇醫(yī)藥
3.363
1.645
2.667
3.047
18.664
-2.268
-1.760
-2.971
18
間-硝基二甲基苯胺
6.981
4.554
20.740
, 百拇醫(yī)藥
5.103
26.045
3.395
1.336
2.594
2.852
24.262
-1.607
-1.908
-3.026
19
2，4-二硝基二苯胺
8.991
, http://www.www.srpcoatings.com
7.096
50.348
8.084
65.351
5.420
1.930
4.392
3.943
38.112
-2.328
-1.681
-2.989
20
, 百拇醫(yī)藥
對(duì)-亞硝基二甲基苯胺
6.573
4.387
19.250
4.877
23.785
3.288
1.237
2.460
2.705
20.087
-1.564
, 百拇醫(yī)藥 -1.998
-3.123
21
N-亞硝基二苯胺
8.037
6.695
44.825
7.758
60.188
5.091
1.771
4.052
3.453
, 百拇醫(yī)藥
23.509
-1.766
-1.950
-2.990
22
對(duì)乙氧基苯胺
6.002
4.220
17.813
4.294
18.435
2.706
1.045
, 百拇醫(yī)藥
2.149
1.900
22.723
-2.324
-1.704
-2.994
23
4-硝基-2-氨基酚
5.481
3.826
14.642
4.428
19.605
, 百拇醫(yī)藥
2.934
1.263
2.134
2.502
20.316
-2.667
-1.487
-2.650
24
乙�；阴；桨�
7.410
5.390
29.048
, 百拇醫(yī)藥
5.858
34.310
3.115
1.550
2.620
1.949
28.683
-3.012
-1.016
-2.100
25
對(duì)氨基苯磺酸
5.679
, http://www.www.srpcoatings.com
4.384
19.222
5.429
29.473
3.344
1.942
2.500
3.200
18.982
-3.191
-1.040
-2.226
*26
, http://www.www.srpcoatings.com
1-硝基-2,4-苯二胺
5.611
3.886
15.097
4.569
20.876
2.922
1.369
2.316
2.516
21.391
*27
, http://www.www.srpcoatings.com
N-乙�；�-對(duì)乙氧基苯胺
7.833
4.340
18.837
5.297
28.061
3.098
1.335
2.670
2.082
30.916
*28
, 百拇醫(yī)藥
2，6-二氯對(duì)硝基苯胺
7.364
4.679
21.893
5.796
33.594
4.186
2.055
3.440
4.241
16.256
1.*為用QSAR模式預(yù)測(cè)其毒性的苯胺同系物
, 百拇醫(yī)藥
2.Y1為PTC50(TC50的負(fù)對(duì)數(shù))，Y2為PSDH(SDH)的負(fù)對(duì)數(shù)，Y3為PLDH(LDH的負(fù)對(duì)數(shù))。
2.QSAR方程的分析：
經(jīng)多元逐步回歸分析，篩選出3個(gè)最具有代表性的QSAR方程，結(jié)果列于表3。表3歸納了25種苯胺類化合物結(jié)構(gòu)與生物活性間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相互關(guān)系。3個(gè)方程均引入了0χv、1χv、2χv和3χvc4個(gè)分子連接指數(shù)和分子負(fù)熵I，說明對(duì)3個(gè)生物活性指標(biāo)來說，這5個(gè)指標(biāo)都具有非常重要的意義。
表3 25種苯胺類化合物的QSAR QSAR方程式
, 百拇醫(yī)藥
n
r
s
Fa
25
0.818
0.380
8.060
25
0.783
0.216
, http://www.www.srpcoatings.com
6.343
25
0.741
0.237
4.852
1.a：F0.05(1,35-5-1)=4.18。
2.C1:TC50,C2:SDH,C3:LDH。
3.n：化合物總數(shù)，r：復(fù)相關(guān)系數(shù)，s：剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差。
3.苯胺同系物毒性的預(yù)測(cè)：
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我們選擇了未參與建立QSAR方程的3種苯胺同系物(表1中26～28號(hào)化合物)，按前文述及的方法計(jì)算其理論參數(shù)(結(jié)果見表2)，應(yīng)用本研究獲得了3個(gè)QSAR方程分別計(jì)算其對(duì)肝細(xì)胞毒性理論值，然后對(duì)按前述實(shí)驗(yàn)方法實(shí)際測(cè)定了這3種化合物對(duì)肝細(xì)胞的毒性大小，結(jié)果見表4。從表4結(jié)果看出，實(shí)際測(cè)定的生物活性值與理論預(yù)測(cè)值非常接近，說明本研究獲得的苯胺類化合物對(duì)大鼠游離肝細(xì)胞毒性的3個(gè)QSAR方程能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)苯胺同系物的毒性大小。
表4 三種苯胺同系物的預(yù)測(cè)結(jié)果 編號(hào)
化合物
log1/TC50
log1/SDH
log1/LDH
OBS
, http://www.www.srpcoatings.com
EST
OBS
EST
OBS
EST
1
1-硝基-2,4-苯二胺
-2.380
-2.492
-1.492
-1.581
-2.611
-2.780
, 百拇醫(yī)藥
2
N-乙�；�-對(duì)乙氧基苯胺
-2.924
-2.760
-1.550
-1.459
-2.974
-2.760
3
2，6-二氯對(duì)硝基苯胺
-2.001
-2.165
, http://www.www.srpcoatings.com
-2.121
-1.927
-2.903
-3.260
OBS為實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值，EST為理論預(yù)測(cè)值
討 論
近年來，已有報(bào)道將游離肝細(xì)胞系統(tǒng)用于篩選肝毒性的化學(xué)物質(zhì)[5]。國(guó)內(nèi)外的研究也都表明，某些具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)游離肝細(xì)胞的毒性大小與其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的急性毒性高度相關(guān)[6，7]。我們采用新鮮游離肝細(xì)胞，對(duì)苯胺類化合物的急性毒性進(jìn)行了體外研究，并作了定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的分析。
有機(jī)化合物的毒性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著極為密切的關(guān)系，化合物產(chǎn)生毒性是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的，改變化合物的結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致其毒性的改變。本研究表明，隨著在母體化合物上引入不同的化學(xué)基團(tuán)，其毒性大小有明顯的差異，例如，凡是在苯環(huán)上引入-NR基團(tuán)的化合物，其毒性顯著高于其它同系物。其次，在苯環(huán)上引入-Br,-Cl等鹵族原子以及-NH2、-OC2H5等基團(tuán)，毒性也較大。本研究獲得的3個(gè)方程顯示了苯胺類化合物的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)與其毒效應(yīng)之間的關(guān)系，3個(gè)方程都引入了能夠定量地描述化合物分子中原子組成和排列的0χv,1χv或(1χv)2,(2χv)2以及3χvc等四種分子連接性指數(shù)。這幾個(gè)指標(biāo)分別反映化合物中側(cè)鏈的類別和位置及取代基的數(shù)目和種類，說明了化合物分子結(jié)構(gòu)和毒效應(yīng)的關(guān)系。另外，3個(gè)方程中均引入了分子負(fù)熵I，化合物分子結(jié)構(gòu)和各部分愈不對(duì)稱，則分子負(fù)熵愈大，毒性也愈大。
, 百拇醫(yī)藥
我們借助本研究獲得的3個(gè)QSAR模式，實(shí)際預(yù)測(cè)了3種苯胺同系物的毒性大小，并通過實(shí)驗(yàn)證明了毒性觀測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值相當(dāng)接近。因此，我們認(rèn)為，本研究獲得的氨基苯類化合物對(duì)大鼠游離肝細(xì)胞毒性的3個(gè)QSAR模式，能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)同系物的毒性大小。
參考文獻(xiàn)
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3.王爾華，等.分子連接性及其在定量構(gòu)效關(guān)系中的應(yīng)用.國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，1979，6(3)：129.
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8.李仁利.定理構(gòu)-效關(guān)系(QSAR)的應(yīng)用及限度.國(guó)外醫(yī)學(xué)藥學(xué)分冊(cè)，1983，10(2)：65.
(修回日期 1998年6月), 百拇醫(yī)藥
單位：牛靜萍 (蘭州醫(yī)學(xué)院環(huán)境衛(wèi)生教研室 730000)； 趙曉紅 (蘭州大學(xué)生物系博士生)
關(guān)鍵詞：定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)；大鼠游離肝細(xì)胞；拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)；細(xì)胞毒性
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志990108 內(nèi)容摘要 以大鼠游離肝細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)和細(xì)胞逸出酶(SDH和LDH)為觀察指標(biāo)，研究了25種苯胺類化合物的肝細(xì)胞毒性，并利用這些毒性效應(yīng)數(shù)據(jù)為因變量，以這些化合物的10種拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)為自變量，利用多元逐步回歸統(tǒng)計(jì)分析方法進(jìn)行了定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)的深入探討。結(jié)果表明，化合物的結(jié)構(gòu)不同則毒性不同，3個(gè)QSAR方程中影響毒性的主要結(jié)構(gòu)參數(shù)有分子連接性指數(shù)0xv、1xv,2xv、3xvc和分子負(fù)熵I。實(shí)驗(yàn)得出的3個(gè)QSAR方程能夠較好地預(yù)測(cè)苯胺類化合物的毒性。
, 百拇醫(yī)藥
Cytotoxicity and quantitative structure-activity relationships (QSAR) of aminobenzene derivatives to rat hepatocytes
Niu Jing-ping
(Lan zhou Medical College，730000)
Zhao Xiao-hong
This study investigated toxicity of 25 aminobenzene derivatives with cellular median toxic concentration(TC50) of isolated rat hepatocytes and enzymes(SDH and LDH) leaked from hepatocytes.These toxic data(TC50,SDH and LDH) were used as dependent variable and 10 topological indices of 25 aminobenzene derivatives were used as independent variable.QSAR was analyzed with multiple stepwise linear regression.The results indicated that there is different toxicity with different structure of compounds.The principal structure parameters in three QSAR equations to affect hepa-to toxicity were molecular connectivity indices(0XV，1XV，2XV，3XVC) and molecular negentropy(Ⅰ).Three equations obtained in this paper could predict the toxicity of aminobenzene derivatives.
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Key words:quantitative structure-activity relationships(QSAR);isolated rat hepatocytes;topological indices; cytotoxicity.
隨著科學(xué)技術(shù)和工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高速發(fā)展，定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(QSAR)是根據(jù)有機(jī)化合物的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和生物學(xué)活性，以一定的數(shù)學(xué)模式，定量地描述它們之間的關(guān)系，其目的是預(yù)測(cè)有機(jī)化合物的生物活性。苯胺類化合物在化學(xué)、國(guó)防、醫(yī)藥等工業(yè)方面有廣泛的應(yīng)用，近年來新合成的此類化合物不斷增加，仍有許多尚未進(jìn)行毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。
本研究采用大鼠游離肝細(xì)胞，以化合物對(duì)肝細(xì)胞毒性的3項(xiàng)指標(biāo)(TC50、LDH、SDH)作為因變量，以反應(yīng)分子結(jié)構(gòu)特征的分子連接性指數(shù)和分子負(fù)熵作為自變量，進(jìn)行逐步回歸分析，以獲得結(jié)構(gòu)-活性“最優(yōu)”數(shù)學(xué)模式，并用模式預(yù)測(cè)了3種苯胺類同系物對(duì)肝細(xì)胞的毒性。
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材料與方法
1.受試物：受試物為25種苯胺類化合物(表1)。受試物均用二甲基亞砜溶解，pH調(diào)至7.2～7.4，配制5種不同濃度的母液備用。
表1 28種苯胺類化合物、結(jié)構(gòu)式、規(guī)格 編號(hào)
化合物
結(jié)構(gòu)式
規(guī)格
編號(hào)
化合物
結(jié)構(gòu)式
規(guī)格
1
, http://www.www.srpcoatings.com
苯 胺
A.P.
11
2,6-二氯苯胺
L.P.
2
鄰甲苯胺
A.P.
12
間溴苯胺
, http://www.www.srpcoatings.com
C.P.
3
間甲苯胺
C.P.
13
鄰硝基苯胺
C.P.
4
對(duì)甲苯胺
A.P.
, http://www.www.srpcoatings.com
14
間硝基苯胺
C.P.
5
N，N-二甲基苯胺
C.P.
15
對(duì)硝基苯胺
C.P.
, 百拇醫(yī)藥 6
N-乙苯胺
A.P.
16
2,4-二硝基苯胺
A.P.
7
N,N-二甲基
-1,4-苯二胺
, 百拇醫(yī)藥 A.P.
17
4-氯-2-硝基
苯胺
L.P.
8
N,N-二乙基
-1,4-苯二胺
C.P.
18
間-硝基二甲
, 百拇醫(yī)藥
基苯胺
E.P.
9
對(duì)苯二胺
L.R.
19
2,4-二硝基二苯胺
C.P.
10
, 百拇醫(yī)藥 鄰氯苯胺
C.P.
20
對(duì)-亞硝基二甲
基苯胺
C.P.
25
對(duì)氨基苯磺酸
A.R.
21
, 百拇醫(yī)藥
N-亞硝基二苯胺
L.R.
26
1-硝基-2,4-苯二胺
C.P.
22
對(duì)乙氧基苯胺
C.P.
27
, 百拇醫(yī)藥
N-乙酰基-對(duì)
乙氧基苯胺
A.R.
23
4-硝基-2-氨基酚
L.R.
28
2,6-二氯對(duì)硝
基苯胺
, http://www.www.srpcoatings.com
L.R
24
乙�；阴；�
苯胺
C.P.
*用QSAR模式預(yù)測(cè)其毒性的苯胺類同系物
2.動(dòng)物選擇及游離肝細(xì)胞的制備：
選用健康雄性SD大鼠，體重在150～200g，大鼠游離肝細(xì)胞的制備采用黃俊勇[1]等人改進(jìn)的方法，細(xì)胞存活率在90%以上者用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞濃度調(diào)至5×105個(gè)/ml培養(yǎng)液，備用。
3.細(xì)胞毒性觀察指標(biāo)及測(cè)定方法：
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(1)細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)的測(cè)定：將細(xì)胞懸液分裝到細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1.5ml，在測(cè)試組每孔加入10μl備用的受試物，設(shè)5個(gè)不同劑量組和對(duì)照組，染毒后混勻，于飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時(shí)，之后用苔盼藍(lán)染色、計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞存活率和死亡率，根據(jù)細(xì)胞死亡率用概率單位法計(jì)算細(xì)胞半數(shù)中毒濃度(TC50)及其負(fù)對(duì)數(shù)(PTC50)。
(2)細(xì)胞逸出酶活性測(cè)定：用上述25種化合物TC50的1/10濃度對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，于飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)2小時(shí)后，200r/min離心5分，取上清液分別測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)和山梨醇脫氫酶(SDH)活性，并分別計(jì)算各自的負(fù)對(duì)數(shù)。LDH測(cè)定用2,4-二硝基苯肼顯測(cè)法。SDH測(cè)定用間苯二酚顯色法[2]。
4.受試物理論參數(shù)的計(jì)算：
目前，在QSAR研究中，理論參數(shù)有兩部分：理化參數(shù)和拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。我們選用拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，其中有：
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(1)分子連接性指數(shù)(mxvt)：分子連接性指數(shù)是表征分子結(jié)構(gòu)特征的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)中最常用的參數(shù)之一，其計(jì)算公式如下：
[3]式中nm是價(jià)為m的t類型子圖的數(shù)目，v表示分子結(jié)構(gòu)中含有雜原子，si為第i個(gè)非氫原子的點(diǎn)價(jià)。
(2)分子負(fù)熵：分子負(fù)熵作為一種表征分子結(jié)構(gòu)信息的參數(shù)可將分子影響其生物活性的突出結(jié)構(gòu)特征譯制出來，其計(jì)算公式如下：
[4]式中N為分子中原子總數(shù)，K為常數(shù)，Pi為某種組合的原子的隨機(jī)選擇機(jī)率。
, 百拇醫(yī)藥
5.QSAR模式的建立：
將TC50、SDH、LDH進(jìn)行負(fù)對(duì)數(shù)變換后，分別作為因變量Y1,Y2,Y3。以苯胺為基本結(jié)構(gòu)計(jì)算出的9種分子連接指數(shù)和分子負(fù)熵作為自變量，進(jìn)行多元逐步回歸分析，以確定最優(yōu)定量結(jié)構(gòu)-活性模式，同時(shí)篩選出與細(xì)胞毒性關(guān)系最為密切的參數(shù)。
結(jié) 果
1.理論參數(shù)計(jì)算及細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果：
25種受試物和3種被預(yù)測(cè)的苯胺同系物的拓樸學(xué)指數(shù)計(jì)算，分別測(cè)定每個(gè)受試物的TC50、SDH和LDH，并計(jì)算各自的負(fù)對(duì)數(shù)Y1,Y2,Y3，結(jié)果列于表2。
表2 28種苯胺類化合物的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)與生物活性 編號(hào)
, 百拇醫(yī)藥
化合物名稱
分子連接性指數(shù)
分子負(fù)熵
I
生物活性
0χv
1χv
(1χv)2
2χv
(2χv)2
, 百拇醫(yī)藥
3χvp
3χvc
4χvp
4χvpc
Y1
Y2
Y3
1
苯胺
, http://www.www.srpcoatings.com
3.964
3.155
9.954
3.736
13.958
2.206
0.913
1.701
1.522
13.035
-3.085
-1.043
-2.210
, http://www.www.srpcoatings.com
2
鄰甲苯胺
4.887
3.533
12.480
4.278
18.301
2.933
1.212
2.043
2.566
18.884
-3.044
, http://www.www.srpcoatings.com
-1.089
-2.273
3
間甲苯胺
4.887
3.521
12.395
4.380
19.185
2.636
1.344
2.236
2.155
, 百拇醫(yī)藥
18.884
-2.469
-1.626
-2.848
4
對(duì)甲苯胺
4.887
3.521
12.395
4.373
19.123
2.706
1.341
, http://www.www.srpcoatings.com
2.003
2.261
16.476
-2.681
-1.462
-2.636
5
N，N-二甲基苯胺
5.834
3.984
15.872
4.518
20.412
, 百拇醫(yī)藥
2.894
1.071
2.222
2.245
18.341
-1.703
-1.848
-3.002
6
N-乙苯胺
5.594
4.177
17.444
, http://www.www.srpcoatings.com
4.199
17.634
2.637
0.874
2.198
1.642
21.579
-2.480
-1.606
-2.837
7
N，N-二甲基-1,4-苯二胺
, 百拇醫(yī)藥 6.334
4.139
17.129
4.789
22.932
3.113
1.288
2.322
2.624
21.252
-1.236
-2.042
-3.147
, http://www.www.srpcoatings.com
8
N，N-二乙基-1，4-苯二胺
7.748
5.291
27.995
5.066
25.670
3.649
1.176
2.919
2.523
29.229
, 百拇醫(yī)藥 -0.788
-2.177
-3.266
9
對(duì)苯二胺
4.464
3.309
10.952
4.007
16.056
2.425
1.129
1.791
, 百拇醫(yī)藥
1.900
10.837
-2.399
-1.637
-2.918
10
鄰氯苯胺
5.091
3.635
13.210
4.439
19.703
3.118
, 百拇醫(yī)藥
1.296
2.150
2.844
15.444
-2.385
-1.660
-2.932
11
2，6-二氯苯胺
6.217
4.108
16.880
5.203
, http://www.www.srpcoatings.com
27.074
3.769
1.771
2.945
3.800
13.035
-2.311
-1.698
-3.006
12
間溴苯胺
5.871
4.013
, 百拇醫(yī)藥
16.102
5.232
27.378
3.248
1.836
2.943
2.921
15.444
-2.081
-1.783
-3.050
13
鄰硝基苯胺
, 百拇醫(yī)藥
5.111
3.737
13.964
4.265
18.194
2.788
1.096
2.188
2.083
18.664
-2.651
-1.478
-2.736
, http://www.www.srpcoatings.com
14
間硝基苯胺
5.111
3.725
13.874
4.322
18.677
2.701
1.178
2.122
2.122
18.664
-2.808
, 百拇醫(yī)藥
-1.380
-2.509
15
對(duì)硝基苯胺
5.111
3.725
13.876
4.315
18.616
2.745
1.175
2.040
2.183
, 百拇醫(yī)藥
16.256
-2.791
-1.412
-2.526
16
2，4-二硝基苯胺
6.259
4.307
18.550
4.851
23.533
3.301
1.377
, 百拇醫(yī)藥
2.522
2.835
21.993
-2.412
-1.609
-2.904
17
4-氯-2-硝基苯胺
6.238
4.205
16.201
5.086
25.866
, 百拇醫(yī)藥
3.363
1.645
2.667
3.047
18.664
-2.268
-1.760
-2.971
18
間-硝基二甲基苯胺
6.981
4.554
20.740
, 百拇醫(yī)藥
5.103
26.045
3.395
1.336
2.594
2.852
24.262
-1.607
-1.908
-3.026
19
2，4-二硝基二苯胺
8.991
, http://www.www.srpcoatings.com
7.096
50.348
8.084
65.351
5.420
1.930
4.392
3.943
38.112
-2.328
-1.681
-2.989
20
, 百拇醫(yī)藥
對(duì)-亞硝基二甲基苯胺
6.573
4.387
19.250
4.877
23.785
3.288
1.237
2.460
2.705
20.087
-1.564
, 百拇醫(yī)藥 -1.998
-3.123
21
N-亞硝基二苯胺
8.037
6.695
44.825
7.758
60.188
5.091
1.771
4.052
3.453
, 百拇醫(yī)藥
23.509
-1.766
-1.950
-2.990
22
對(duì)乙氧基苯胺
6.002
4.220
17.813
4.294
18.435
2.706
1.045
, 百拇醫(yī)藥
2.149
1.900
22.723
-2.324
-1.704
-2.994
23
4-硝基-2-氨基酚
5.481
3.826
14.642
4.428
19.605
, 百拇醫(yī)藥
2.934
1.263
2.134
2.502
20.316
-2.667
-1.487
-2.650
24
乙�；阴；桨�
7.410
5.390
29.048
, 百拇醫(yī)藥
5.858
34.310
3.115
1.550
2.620
1.949
28.683
-3.012
-1.016
-2.100
25
對(duì)氨基苯磺酸
5.679
, http://www.www.srpcoatings.com
4.384
19.222
5.429
29.473
3.344
1.942
2.500
3.200
18.982
-3.191
-1.040
-2.226
*26
, http://www.www.srpcoatings.com
1-硝基-2,4-苯二胺
5.611
3.886
15.097
4.569
20.876
2.922
1.369
2.316
2.516
21.391
*27
, http://www.www.srpcoatings.com
N-乙�；�-對(duì)乙氧基苯胺
7.833
4.340
18.837
5.297
28.061
3.098
1.335
2.670
2.082
30.916
*28
, 百拇醫(yī)藥
2，6-二氯對(duì)硝基苯胺
7.364
4.679
21.893
5.796
33.594
4.186
2.055
3.440
4.241
16.256
1.*為用QSAR模式預(yù)測(cè)其毒性的苯胺同系物
, 百拇醫(yī)藥
2.Y1為PTC50(TC50的負(fù)對(duì)數(shù))，Y2為PSDH(SDH)的負(fù)對(duì)數(shù)，Y3為PLDH(LDH的負(fù)對(duì)數(shù))。
2.QSAR方程的分析：
經(jīng)多元逐步回歸分析，篩選出3個(gè)最具有代表性的QSAR方程，結(jié)果列于表3。表3歸納了25種苯胺類化合物結(jié)構(gòu)與生物活性間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相互關(guān)系。3個(gè)方程均引入了0χv、1χv、2χv和3χvc4個(gè)分子連接指數(shù)和分子負(fù)熵I，說明對(duì)3個(gè)生物活性指標(biāo)來說，這5個(gè)指標(biāo)都具有非常重要的意義。
表3 25種苯胺類化合物的QSAR QSAR方程式
, 百拇醫(yī)藥
n
r
s
Fa
25
0.818
0.380
8.060
25
0.783
0.216
, http://www.www.srpcoatings.com
6.343
25
0.741
0.237
4.852
1.a：F0.05(1,35-5-1)=4.18。
2.C1:TC50,C2:SDH,C3:LDH。
3.n：化合物總數(shù)，r：復(fù)相關(guān)系數(shù)，s：剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差。
3.苯胺同系物毒性的預(yù)測(cè)：
, http://www.www.srpcoatings.com
我們選擇了未參與建立QSAR方程的3種苯胺同系物(表1中26～28號(hào)化合物)，按前文述及的方法計(jì)算其理論參數(shù)(結(jié)果見表2)，應(yīng)用本研究獲得了3個(gè)QSAR方程分別計(jì)算其對(duì)肝細(xì)胞毒性理論值，然后對(duì)按前述實(shí)驗(yàn)方法實(shí)際測(cè)定了這3種化合物對(duì)肝細(xì)胞的毒性大小，結(jié)果見表4。從表4結(jié)果看出，實(shí)際測(cè)定的生物活性值與理論預(yù)測(cè)值非常接近，說明本研究獲得的苯胺類化合物對(duì)大鼠游離肝細(xì)胞毒性的3個(gè)QSAR方程能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)苯胺同系物的毒性大小。
表4 三種苯胺同系物的預(yù)測(cè)結(jié)果 編號(hào)
化合物
log1/TC50
log1/SDH
log1/LDH
OBS
, http://www.www.srpcoatings.com
EST
OBS
EST
OBS
EST
1
1-硝基-2,4-苯二胺
-2.380
-2.492
-1.492
-1.581
-2.611
-2.780
, 百拇醫(yī)藥
2
N-乙�；�-對(duì)乙氧基苯胺
-2.924
-2.760
-1.550
-1.459
-2.974
-2.760
3
2，6-二氯對(duì)硝基苯胺
-2.001
-2.165
, http://www.www.srpcoatings.com
-2.121
-1.927
-2.903
-3.260
OBS為實(shí)驗(yàn)觀測(cè)值，EST為理論預(yù)測(cè)值
討 論
近年來，已有報(bào)道將游離肝細(xì)胞系統(tǒng)用于篩選肝毒性的化學(xué)物質(zhì)[5]。國(guó)內(nèi)外的研究也都表明，某些具有相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)對(duì)游離肝細(xì)胞的毒性大小與其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的急性毒性高度相關(guān)[6，7]。我們采用新鮮游離肝細(xì)胞，對(duì)苯胺類化合物的急性毒性進(jìn)行了體外研究，并作了定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的分析。
有機(jī)化合物的毒性與其化學(xué)結(jié)構(gòu)有著極為密切的關(guān)系，化合物產(chǎn)生毒性是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定的，改變化合物的結(jié)構(gòu)將導(dǎo)致其毒性的改變。本研究表明，隨著在母體化合物上引入不同的化學(xué)基團(tuán)，其毒性大小有明顯的差異，例如，凡是在苯環(huán)上引入-NR基團(tuán)的化合物，其毒性顯著高于其它同系物。其次，在苯環(huán)上引入-Br,-Cl等鹵族原子以及-NH2、-OC2H5等基團(tuán)，毒性也較大。本研究獲得的3個(gè)方程顯示了苯胺類化合物的拓?fù)鋵W(xué)指數(shù)與其毒效應(yīng)之間的關(guān)系，3個(gè)方程都引入了能夠定量地描述化合物分子中原子組成和排列的0χv,1χv或(1χv)2,(2χv)2以及3χvc等四種分子連接性指數(shù)。這幾個(gè)指標(biāo)分別反映化合物中側(cè)鏈的類別和位置及取代基的數(shù)目和種類，說明了化合物分子結(jié)構(gòu)和毒效應(yīng)的關(guān)系。另外，3個(gè)方程中均引入了分子負(fù)熵I，化合物分子結(jié)構(gòu)和各部分愈不對(duì)稱，則分子負(fù)熵愈大，毒性也愈大。
, 百拇醫(yī)藥
我們借助本研究獲得的3個(gè)QSAR模式，實(shí)際預(yù)測(cè)了3種苯胺同系物的毒性大小，并通過實(shí)驗(yàn)證明了毒性觀測(cè)值與理論預(yù)測(cè)值相當(dāng)接近。因此，我們認(rèn)為，本研究獲得的氨基苯類化合物對(duì)大鼠游離肝細(xì)胞毒性的3個(gè)QSAR模式，能夠較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)同系物的毒性大小。
參考文獻(xiàn)
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(修回日期 1998年6月), 百拇醫(yī)藥