4種金屬化合物對(duì)小鼠生殖細(xì)胞DNA損傷的研究
作者：張遵真 衡正昌 廖艷 趙蓉
單位：張遵真 衡正昌(華西醫(yī)科大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生教研室，成都 610041)；廖艷 趙蓉(2.95級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)生)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000414 隨著工業(yè)化的發(fā)展和礦資源的開(kāi)發(fā)利用，重金屬對(duì)環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重。其中鎘、鉻、鉛、汞是常見(jiàn)的環(huán)境和工業(yè)毒物，有關(guān)其遺傳毒性的報(bào)道較多。研究已證明[1，2]：鎘和鉻是確定的人類致癌物，汞對(duì)真核細(xì)胞具有致裂作用，鉛可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟腫瘤，屬人類可疑致癌物，但有關(guān)其是否能夠直接誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的DNA損傷未見(jiàn)報(bào)道。彗星試驗(yàn)(Comet assay)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA鏈斷裂的新技術(shù)，具有敏感、簡(jiǎn)便、所需樣品少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)[3]。我們采用彗星試驗(yàn)檢測(cè)了4種金屬化合物對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞的DNA損傷，為全面評(píng)價(jià)重金屬的遺傳毒性和雄性生殖毒性提供科學(xué)依據(jù)。
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1 材料與方法
1.1 受試物 硫酸鎘(CdSO4)、重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、氯化汞(HgCl2)均為成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?純度>98%)，臨用前以滅菌雙蒸水配置。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠，體重25 g左右，由華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。常規(guī)喂養(yǎng)，觀察1周后，健康者供實(shí)驗(yàn)用。
1.3 小鼠精原細(xì)胞的制備：頸椎銳臼處死小鼠，取出兩側(cè)睪丸，放于35 mm玻璃平皿內(nèi)，用預(yù)溫的37 ℃Hanks液沖洗2次，小心除去被膜和血管，然后轉(zhuǎn)移至小燒杯內(nèi)，加少許Hanks液，用眼科剪盡量剪碎曲細(xì)精管，以一定量Hanks液稀釋后，通過(guò)110目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，離心后用Hanks液將細(xì)胞濃度調(diào)整為106～107個(gè)/ml，4 ℃貯存?zhèn)溆�，并以苔盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率。
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1.4 細(xì)胞處理 將上述制得的小鼠精原細(xì)胞按每管105～106個(gè)細(xì)胞分裝于5 ml刻度離心管，再用無(wú)血清的Dubico改良的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液將體積加至3 ml，然后于每管中分別加入不同濃度的受試物30 μl，同時(shí)以30 μl雙蒸水作陰性對(duì)照，30 μl過(guò)氧化氫(H2O2)作陽(yáng)性對(duì)照，混勻后置37 ℃恒溫水浴震蕩(震蕩頻率為100次/min)箱孵育1.5 h(H2O2只孵育30 min)。染毒完畢，離心去上清液，以100 μl Hanks液重懸細(xì)胞，用于彗星試驗(yàn)，并以苔盼藍(lán)排斥法觀察染毒后的細(xì)胞存活率，以反映受試物對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
1.5 彗星試驗(yàn)[4]
1.5.1 制片 將110 μl質(zhì)量濃度為0.8%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖澆注在毛玻片上作為第1層；凝固后，加入75 μl含有103～104個(gè)細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖(質(zhì)量濃度為0.8%)作為第2層，并加蓋玻片置4 ℃固化10 min。
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1.5.2 裂解 待第2層膠凝固后取下蓋玻片，將載玻片放入新配制的細(xì)胞裂解液(pH=10)中，置4 ℃冰箱避光裂解至少1 h。
1.5.3 解旋(堿變性) 裂解完畢，用磷酸緩沖液(PBS，pH=7)浸泡片子，以洗去裂解液中高濃度的鹽。然后將玻片水平放于電泳盒，倒入新配制的電泳緩沖液(pH=12)，使液面高于凝膠約2 mm，避光解旋30 min。
1.5.4 電泳 調(diào)節(jié)電壓為20 V，電流200 mA，電泳30 min。電泳時(shí)帶負(fù)電荷的DNA斷片將離開(kāi)主核向陽(yáng)極遷移，形成一個(gè)象彗星樣的拖尾，尾的長(zhǎng)短與DNA損傷的程度相關(guān)。
1.5.5 染色和結(jié)果觀察 電泳完畢取出玻片，用PBS浸泡2次，以中和堿性。每片用40 μl溴乙錠染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。每張片子隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出拖尾細(xì)胞百分率，并用目鏡測(cè)微尺測(cè)量30個(gè)拖尾細(xì)胞的尾長(zhǎng)，計(jì)算出每組的DNA遷移長(zhǎng)度。
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1.5.6 統(tǒng)計(jì)分析 與雙蒸水組比較，分別用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)對(duì)各組的拖尾細(xì)胞百分率及DNA遷移長(zhǎng)度(尾長(zhǎng))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。上述實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上。
2 結(jié)果
2.1 精原細(xì)胞的分離及細(xì)胞存活率 按照方法中描述的程序分離小鼠精原細(xì)胞，可以得到足夠數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行彗星試驗(yàn)。鏡下可見(jiàn)：細(xì)胞呈圓形，形態(tài)較均一，且分散良好。經(jīng)苔盼藍(lán)排斥法染色，其細(xì)胞存活率均在95%以上。顯示出該法分離小鼠精原細(xì)胞，快速簡(jiǎn)便，而且細(xì)胞存活率高。
2.2 受試物對(duì)精原細(xì)胞的細(xì)胞毒性 細(xì)胞與受試物作用1.5 h后，發(fā)現(xiàn)HgCl2的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，0.016 mmol/L組僅有40%細(xì)胞存活，而其他受試物在這一濃度下完全沒(méi)有細(xì)胞毒性。其次是CdSO4，0.2 mmol/L組細(xì)胞存活率為50%，而Pb(NO3)2濃度達(dá)1 mmol/L時(shí)也未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。因此，4種受試物細(xì)胞毒性的順序從大到小依次為HgCl2、CdSO4、K2Cr2O\-7、Pb(NO4)2。
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2.3 4種金屬化合物對(duì)精原細(xì)胞DNA的損傷作用(表1) H2O2染毒30 min，其余受試物染毒1.5 h。
表1 4種金屬化合物對(duì)精原細(xì)胞的DNA損傷(
+s) 受試物
濃度(mmol/L)
拖尾率(%)
尾長(zhǎng)(μm)
雙蒸水
-
0
0
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H2Oa2
0.025
100#
138.6±12.8*
K2Cr2O7
0.005
26#
20.4±2.3*
0.025
84#
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47.2±5.6*
0.125
100
80.5±7.8*
0.725
100#
112.0±10*
CbSO4
0.025
32#
13.2±2.5*
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0.05
51#
30.6±4.8*
0.1
86#
67.4±6.6*
0.2
100#
Pb(NO3)2
0.125
22#
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25.3±2.8*
0.25
40#
52.4±5.0*
0.5
78#
64.5±6.0*
1.0
100#
88.7±9.0*
HgCl2
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0.002
28#
15.6±2.7*
0.004
40#
32.1±3.2*
0.008
75#
54.2±5.8*
0.016
88#
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—
χ2檢驗(yàn)，與雙蒸水組比較，#P<0.01；t檢驗(yàn)，與雙蒸水組比較，*P<0.01
從表1可見(jiàn)：在本實(shí)驗(yàn)條件下，陰性對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生DNA遷移，拖尾率為零。陽(yáng)性對(duì)照H2O2僅染毒30 min，所有細(xì)胞均出現(xiàn)拖尾，其尾長(zhǎng)達(dá)(138.6±12.8) μm。在相同條件下，4種受試物均可在一定濃度范圍內(nèi)引起小鼠精原細(xì)胞的DNA單鏈斷裂，形成彗形細(xì)胞，而且，拖尾細(xì)胞百分率和各組尾長(zhǎng)均隨受試物濃度的增加而增加。此外，結(jié)果還顯示出各受試物誘導(dǎo)DNA損傷的濃度范圍相差很大。如HgCl2僅在一個(gè)較小的濃度范圍內(nèi)(0.002～0.008 mmol/L)具有DNA損傷作用，小于0.002 mmol/L這一濃度時(shí)，不能引起DNA斷裂，大于0.008 mmol/L時(shí)，則表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。而Pb(NO3)2則要在較高濃度時(shí)(0.125～1.0 mmol/L)才具有DNA損傷作用。
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3 討論
3.1 彗星試驗(yàn)及其細(xì)胞毒性測(cè)量的意義 彗星試驗(yàn)常以拖尾細(xì)胞百分率和DNA遷移長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在電壓、電流和電泳時(shí)間一定時(shí)，DNA遷移長(zhǎng)度與DNA損傷的多少及斷片的大小有關(guān)，然而，任何原因造成的細(xì)胞死亡也會(huì)發(fā)生DNA崩解，在電場(chǎng)作用下形成特殊的彗星。因此，在實(shí)驗(yàn)染毒期間，如果受試物具有很大的細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞死亡，這種情況所致的彗星細(xì)胞及尾長(zhǎng)并非受試物遺傳毒性所致，而是細(xì)胞毒性引起的細(xì)胞死亡造成，是假陽(yáng)性。所以，彗星試驗(yàn)中測(cè)量受試物的細(xì)胞毒性非常必要。一般認(rèn)為，細(xì)胞存活率要高于80%才能進(jìn)行遺傳毒性的檢測(cè)[5]。本實(shí)驗(yàn)中，0.016 mmol/L HgCl2和0.2 mmol/L CdSO4染毒后細(xì)胞存活率分別為40%和50%，故該組DNA遷移長(zhǎng)度沒(méi)有測(cè)量。
3.2 4種金屬化合物對(duì)小鼠生殖細(xì)胞的DNA損傷 經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示，4種金屬化合物可在無(wú)明顯細(xì)胞毒性的濃度下誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞的DNA損傷，說(shuō)明受試物具有雄性生殖毒性，可能是潛在的雄性生殖毒物。
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鉻及其化合物是已證實(shí)的人類致癌物，近10年來(lái)對(duì)鉻的致癌機(jī)制研究十分活躍，主要集中在鉻化合物導(dǎo)致DNA損傷及其有關(guān)機(jī)制方面[6]。而關(guān)于鉻的生殖毒性報(bào)道甚少，有研究顯示[7]，小鼠受孕后7～9 d，腹腔注射三氯化鉻19.52 mg/kg，于妊娠第18天宰殺，即可見(jiàn)到胎兒有明顯的畸形。本研究顯示重鉻酸鉀具有很強(qiáng)的致生殖細(xì)胞DNA損傷的作用，在0.125 mmol/L時(shí)可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞全部拖尾，尾長(zhǎng)達(dá)(80.5±7.8)μm，提示鉻可能具有潛在生殖毒性。至于鉻致DNA損傷的機(jī)制，認(rèn)為與鉻的單電子氧化還原循環(huán)有關(guān)，且羥自由基(*OH)是導(dǎo)致DNA斷裂的主要因素。
鎘也是確證的人類致癌物，可引起多器官系統(tǒng)毒性。大量實(shí)驗(yàn)研究已證明，睪丸和附睪對(duì)鎘的毒作用最敏感，但對(duì)其雄性生殖毒作用機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為鎘首先損害睪丸和附睪的血管系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致曲細(xì)精管和附睪管的改變，從而引起一系列形態(tài)和組織學(xué)的變化。有研究報(bào)道，用氯化鎘處理睪丸細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)睪丸細(xì)胞呈簇脫落，次級(jí)精母細(xì)胞呈空泡狀變形壞死，并伴隨著多種酶活性的改變，支持鎘對(duì)睪丸具有直接性腺毒性的結(jié)論。也有報(bào)道，鎘還可引起人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生DNA單鏈斷裂，是一種DNA損傷劑。本研究結(jié)果表明，鎘對(duì)睪丸細(xì)胞既具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性也具有遺傳毒性。
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目前，汞化合物的一般毒性主要表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)，無(wú)機(jī)汞是否具有生殖毒性未見(jiàn)報(bào)道。已知汞對(duì)染色體具有致裂作用(clastogenesis)，并可抑制DNA合成和修復(fù)。汞的許多毒性與Hg2+和體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的巰基(-SH)、二巰基(-S-S)具有很強(qiáng)的親和力有關(guān)。本研究表明在4種受試物中，氯化汞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，而且很低劑量(0.002 mmol/L)即可誘導(dǎo)精原細(xì)胞DNA單鏈斷裂，說(shuō)明氯化汞是一種DNA損傷劑。
鉛屬人類可疑致癌物，同時(shí)具有明顯的性腺、胚胎毒性和致畸作用。小劑量(0.002～0.2 mg/kg)和短時(shí)間(10 d中作用6次)的作用不能引起大鼠的一般狀態(tài)、血液及神經(jīng)系統(tǒng)改變，但可見(jiàn)大鼠的睪丸和前列腺增重，精子生成受到破壞，有絲分裂異常，性細(xì)胞中RNA的合成和分解降低。也有報(bào)道交尾前或懷胎期體內(nèi)注入鉛的大鼠，經(jīng)常流產(chǎn)或多為死產(chǎn)，胎鼠發(fā)育不全[7]。本實(shí)驗(yàn)鉛在0.125～1.0 mmol/L范圍內(nèi)可引起小鼠精原細(xì)胞DNA遷移，并且具有明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明鉛能直接造成DNA損傷，這與前人用堿洗脫法研究所得的結(jié)果一致。
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綜上所述，彗星試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出較低劑量的CdSO4、K2Cr2O7、Pb(NO4)2、HgCl2誘導(dǎo)的小鼠精原細(xì)胞DNA單鏈斷裂，說(shuō)明這4種金屬化合物都是DNA損傷劑，具有潛在的雄性生殖毒性，同時(shí)也反映出彗星試驗(yàn)在檢測(cè)金屬遺傳毒性方面的敏感性。
本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(39670625)
參考文獻(xiàn)
[1] Friberg L,Elinder CG,Kjellstrom T.Environmental health criteria 134 cadimum.Geneva:UNEPILO WHO,1992.97-129.
[2] 夏世均.鉻極其化合物.見(jiàn)：吳執(zhí)中，主編.職業(yè)病.北京：人民衛(wèi)生出版社，1981.62-74.
, http://www.www.srpcoatings.com
[3] Fairbaim DW,Olive PL，O'Neill KL.Comet assay,a comprehensive review.Mutat Res,1995，339:37-59.
[4] 張遵真，衡正昌.用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)鉻和砷化合物的DNA損傷作用.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1997，31：356-357.
[5] Kirkland DJ,Gallloway SM,Sofuni T.Summay of major conclusions.Mutat Res,1994，312:205-209.
[6] 劉翔，劉世杰.鉻化合物的DNA損傷作用及其機(jī)制.癌變.畸變.突變，1998.60-62.
[7] 張尤恩.鉛污染與健康.見(jiàn)：蔡宏道，主編.現(xiàn)代環(huán)境衛(wèi)生學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1995.731-743.
(收稿日期：1999-06-17), http://www.www.srpcoatings.com
單位：張遵真 衡正昌(華西醫(yī)科大學(xué)環(huán)境衛(wèi)生教研室，成都 610041)；廖艷 趙蓉(2.95級(jí)預(yù)防醫(yī)學(xué)學(xué)生)
關(guān)鍵詞：
衛(wèi)生毒理學(xué)雜志000414 隨著工業(yè)化的發(fā)展和礦資源的開(kāi)發(fā)利用，重金屬對(duì)環(huán)境的污染越來(lái)越嚴(yán)重。其中鎘、鉻、鉛、汞是常見(jiàn)的環(huán)境和工業(yè)毒物，有關(guān)其遺傳毒性的報(bào)道較多。研究已證明[1，2]：鎘和鉻是確定的人類致癌物，汞對(duì)真核細(xì)胞具有致裂作用，鉛可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腎臟腫瘤，屬人類可疑致癌物，但有關(guān)其是否能夠直接誘導(dǎo)生殖細(xì)胞的DNA損傷未見(jiàn)報(bào)道。彗星試驗(yàn)(Comet assay)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的檢測(cè)單個(gè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA鏈斷裂的新技術(shù)，具有敏感、簡(jiǎn)便、所需樣品少等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)[3]。我們采用彗星試驗(yàn)檢測(cè)了4種金屬化合物對(duì)雄性小鼠生殖細(xì)胞的DNA損傷，為全面評(píng)價(jià)重金屬的遺傳毒性和雄性生殖毒性提供科學(xué)依據(jù)。
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1 材料與方法
1.1 受試物 硫酸鎘(CdSO4)、重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、硝酸鉛(Pb(NO3)2)、氯化汞(HgCl2)均為成都化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的分析純?cè)噭?純度>98%)，臨用前以滅菌雙蒸水配置。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種雄性小鼠，體重25 g左右，由華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。常規(guī)喂養(yǎng)，觀察1周后，健康者供實(shí)驗(yàn)用。
1.3 小鼠精原細(xì)胞的制備：頸椎銳臼處死小鼠，取出兩側(cè)睪丸，放于35 mm玻璃平皿內(nèi)，用預(yù)溫的37 ℃Hanks液沖洗2次，小心除去被膜和血管，然后轉(zhuǎn)移至小燒杯內(nèi)，加少許Hanks液，用眼科剪盡量剪碎曲細(xì)精管，以一定量Hanks液稀釋后，通過(guò)110目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，收集細(xì)胞懸液，離心后用Hanks液將細(xì)胞濃度調(diào)整為106～107個(gè)/ml，4 ℃貯存?zhèn)溆�，并以苔盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率。
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1.4 細(xì)胞處理 將上述制得的小鼠精原細(xì)胞按每管105～106個(gè)細(xì)胞分裝于5 ml刻度離心管，再用無(wú)血清的Dubico改良的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制的培養(yǎng)液將體積加至3 ml，然后于每管中分別加入不同濃度的受試物30 μl，同時(shí)以30 μl雙蒸水作陰性對(duì)照，30 μl過(guò)氧化氫(H2O2)作陽(yáng)性對(duì)照，混勻后置37 ℃恒溫水浴震蕩(震蕩頻率為100次/min)箱孵育1.5 h(H2O2只孵育30 min)。染毒完畢，離心去上清液，以100 μl Hanks液重懸細(xì)胞，用于彗星試驗(yàn)，并以苔盼藍(lán)排斥法觀察染毒后的細(xì)胞存活率，以反映受試物對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
1.5 彗星試驗(yàn)[4]
1.5.1 制片 將110 μl質(zhì)量濃度為0.8%的正常熔點(diǎn)瓊脂糖澆注在毛玻片上作為第1層；凝固后，加入75 μl含有103～104個(gè)細(xì)胞的低熔點(diǎn)瓊脂糖(質(zhì)量濃度為0.8%)作為第2層，并加蓋玻片置4 ℃固化10 min。
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1.5.2 裂解 待第2層膠凝固后取下蓋玻片，將載玻片放入新配制的細(xì)胞裂解液(pH=10)中，置4 ℃冰箱避光裂解至少1 h。
1.5.3 解旋(堿變性) 裂解完畢，用磷酸緩沖液(PBS，pH=7)浸泡片子，以洗去裂解液中高濃度的鹽。然后將玻片水平放于電泳盒，倒入新配制的電泳緩沖液(pH=12)，使液面高于凝膠約2 mm，避光解旋30 min。
1.5.4 電泳 調(diào)節(jié)電壓為20 V，電流200 mA，電泳30 min。電泳時(shí)帶負(fù)電荷的DNA斷片將離開(kāi)主核向陽(yáng)極遷移，形成一個(gè)象彗星樣的拖尾，尾的長(zhǎng)短與DNA損傷的程度相關(guān)。
1.5.5 染色和結(jié)果觀察 電泳完畢取出玻片，用PBS浸泡2次，以中和堿性。每片用40 μl溴乙錠染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。每張片子隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，求出拖尾細(xì)胞百分率，并用目鏡測(cè)微尺測(cè)量30個(gè)拖尾細(xì)胞的尾長(zhǎng)，計(jì)算出每組的DNA遷移長(zhǎng)度。
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1.5.6 統(tǒng)計(jì)分析 與雙蒸水組比較，分別用χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)對(duì)各組的拖尾細(xì)胞百分率及DNA遷移長(zhǎng)度(尾長(zhǎng))進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。上述實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次以上。
2 結(jié)果
2.1 精原細(xì)胞的分離及細(xì)胞存活率 按照方法中描述的程序分離小鼠精原細(xì)胞，可以得到足夠數(shù)量的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行彗星試驗(yàn)。鏡下可見(jiàn)：細(xì)胞呈圓形，形態(tài)較均一，且分散良好。經(jīng)苔盼藍(lán)排斥法染色，其細(xì)胞存活率均在95%以上。顯示出該法分離小鼠精原細(xì)胞，快速簡(jiǎn)便，而且細(xì)胞存活率高。
2.2 受試物對(duì)精原細(xì)胞的細(xì)胞毒性 細(xì)胞與受試物作用1.5 h后，發(fā)現(xiàn)HgCl2的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，0.016 mmol/L組僅有40%細(xì)胞存活，而其他受試物在這一濃度下完全沒(méi)有細(xì)胞毒性。其次是CdSO4，0.2 mmol/L組細(xì)胞存活率為50%，而Pb(NO3)2濃度達(dá)1 mmol/L時(shí)也未表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。因此，4種受試物細(xì)胞毒性的順序從大到小依次為HgCl2、CdSO4、K2Cr2O\-7、Pb(NO4)2。
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2.3 4種金屬化合物對(duì)精原細(xì)胞DNA的損傷作用(表1) H2O2染毒30 min，其余受試物染毒1.5 h。
表1 4種金屬化合物對(duì)精原細(xì)胞的DNA損傷(
+s) 受試物濃度(mmol/L)
拖尾率(%)
尾長(zhǎng)(μm)
雙蒸水
-
0
0
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H2Oa2
0.025
100#
138.6±12.8*
K2Cr2O7
0.005
26#
20.4±2.3*
0.025
84#
, 百拇醫(yī)藥
47.2±5.6*
0.125
100
80.5±7.8*
0.725
100#
112.0±10*
CbSO4
0.025
32#
13.2±2.5*
, 百拇醫(yī)藥
0.05
51#
30.6±4.8*
0.1
86#
67.4±6.6*
0.2
100#
Pb(NO3)2
0.125
22#
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25.3±2.8*
0.25
40#
52.4±5.0*
0.5
78#
64.5±6.0*
1.0
100#
88.7±9.0*
HgCl2
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0.002
28#
15.6±2.7*
0.004
40#
32.1±3.2*
0.008
75#
54.2±5.8*
0.016
88#
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χ2檢驗(yàn)，與雙蒸水組比較，#P<0.01；t檢驗(yàn)，與雙蒸水組比較，*P<0.01
從表1可見(jiàn)：在本實(shí)驗(yàn)條件下，陰性對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有發(fā)生DNA遷移，拖尾率為零。陽(yáng)性對(duì)照H2O2僅染毒30 min，所有細(xì)胞均出現(xiàn)拖尾，其尾長(zhǎng)達(dá)(138.6±12.8) μm。在相同條件下，4種受試物均可在一定濃度范圍內(nèi)引起小鼠精原細(xì)胞的DNA單鏈斷裂，形成彗形細(xì)胞，而且，拖尾細(xì)胞百分率和各組尾長(zhǎng)均隨受試物濃度的增加而增加。此外，結(jié)果還顯示出各受試物誘導(dǎo)DNA損傷的濃度范圍相差很大。如HgCl2僅在一個(gè)較小的濃度范圍內(nèi)(0.002～0.008 mmol/L)具有DNA損傷作用，小于0.002 mmol/L這一濃度時(shí)，不能引起DNA斷裂，大于0.008 mmol/L時(shí)，則表現(xiàn)出明顯細(xì)胞毒性。而Pb(NO3)2則要在較高濃度時(shí)(0.125～1.0 mmol/L)才具有DNA損傷作用。
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3 討論
3.1 彗星試驗(yàn)及其細(xì)胞毒性測(cè)量的意義 彗星試驗(yàn)常以拖尾細(xì)胞百分率和DNA遷移長(zhǎng)度作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在電壓、電流和電泳時(shí)間一定時(shí)，DNA遷移長(zhǎng)度與DNA損傷的多少及斷片的大小有關(guān)，然而，任何原因造成的細(xì)胞死亡也會(huì)發(fā)生DNA崩解，在電場(chǎng)作用下形成特殊的彗星。因此，在實(shí)驗(yàn)染毒期間，如果受試物具有很大的細(xì)胞毒性，引起細(xì)胞死亡，這種情況所致的彗星細(xì)胞及尾長(zhǎng)并非受試物遺傳毒性所致，而是細(xì)胞毒性引起的細(xì)胞死亡造成，是假陽(yáng)性。所以，彗星試驗(yàn)中測(cè)量受試物的細(xì)胞毒性非常必要。一般認(rèn)為，細(xì)胞存活率要高于80%才能進(jìn)行遺傳毒性的檢測(cè)[5]。本實(shí)驗(yàn)中，0.016 mmol/L HgCl2和0.2 mmol/L CdSO4染毒后細(xì)胞存活率分別為40%和50%，故該組DNA遷移長(zhǎng)度沒(méi)有測(cè)量。
3.2 4種金屬化合物對(duì)小鼠生殖細(xì)胞的DNA損傷 經(jīng)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均顯示，4種金屬化合物可在無(wú)明顯細(xì)胞毒性的濃度下誘導(dǎo)小鼠精原細(xì)胞的DNA損傷，說(shuō)明受試物具有雄性生殖毒性，可能是潛在的雄性生殖毒物。
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鉻及其化合物是已證實(shí)的人類致癌物，近10年來(lái)對(duì)鉻的致癌機(jī)制研究十分活躍，主要集中在鉻化合物導(dǎo)致DNA損傷及其有關(guān)機(jī)制方面[6]。而關(guān)于鉻的生殖毒性報(bào)道甚少，有研究顯示[7]，小鼠受孕后7～9 d，腹腔注射三氯化鉻19.52 mg/kg，于妊娠第18天宰殺，即可見(jiàn)到胎兒有明顯的畸形。本研究顯示重鉻酸鉀具有很強(qiáng)的致生殖細(xì)胞DNA損傷的作用，在0.125 mmol/L時(shí)可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞全部拖尾，尾長(zhǎng)達(dá)(80.5±7.8)μm，提示鉻可能具有潛在生殖毒性。至于鉻致DNA損傷的機(jī)制，認(rèn)為與鉻的單電子氧化還原循環(huán)有關(guān)，且羥自由基(*OH)是導(dǎo)致DNA斷裂的主要因素。
鎘也是確證的人類致癌物，可引起多器官系統(tǒng)毒性。大量實(shí)驗(yàn)研究已證明，睪丸和附睪對(duì)鎘的毒作用最敏感，但對(duì)其雄性生殖毒作用機(jī)制尚不完全清楚。目前認(rèn)為鎘首先損害睪丸和附睪的血管系統(tǒng)，進(jìn)而導(dǎo)致曲細(xì)精管和附睪管的改變，從而引起一系列形態(tài)和組織學(xué)的變化。有研究報(bào)道，用氯化鎘處理睪丸細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)睪丸細(xì)胞呈簇脫落，次級(jí)精母細(xì)胞呈空泡狀變形壞死，并伴隨著多種酶活性的改變，支持鎘對(duì)睪丸具有直接性腺毒性的結(jié)論。也有報(bào)道，鎘還可引起人外周血淋巴細(xì)胞產(chǎn)生DNA單鏈斷裂，是一種DNA損傷劑。本研究結(jié)果表明，鎘對(duì)睪丸細(xì)胞既具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性也具有遺傳毒性。
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目前，汞化合物的一般毒性主要表現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)，無(wú)機(jī)汞是否具有生殖毒性未見(jiàn)報(bào)道。已知汞對(duì)染色體具有致裂作用(clastogenesis)，并可抑制DNA合成和修復(fù)。汞的許多毒性與Hg2+和體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的巰基(-SH)、二巰基(-S-S)具有很強(qiáng)的親和力有關(guān)。本研究表明在4種受試物中，氯化汞的細(xì)胞毒性最強(qiáng)，而且很低劑量(0.002 mmol/L)即可誘導(dǎo)精原細(xì)胞DNA單鏈斷裂，說(shuō)明氯化汞是一種DNA損傷劑。
鉛屬人類可疑致癌物，同時(shí)具有明顯的性腺、胚胎毒性和致畸作用。小劑量(0.002～0.2 mg/kg)和短時(shí)間(10 d中作用6次)的作用不能引起大鼠的一般狀態(tài)、血液及神經(jīng)系統(tǒng)改變，但可見(jiàn)大鼠的睪丸和前列腺增重，精子生成受到破壞，有絲分裂異常，性細(xì)胞中RNA的合成和分解降低。也有報(bào)道交尾前或懷胎期體內(nèi)注入鉛的大鼠，經(jīng)常流產(chǎn)或多為死產(chǎn)，胎鼠發(fā)育不全[7]。本實(shí)驗(yàn)鉛在0.125～1.0 mmol/L范圍內(nèi)可引起小鼠精原細(xì)胞DNA遷移，并且具有明顯劑量反應(yīng)關(guān)系，說(shuō)明鉛能直接造成DNA損傷，這與前人用堿洗脫法研究所得的結(jié)果一致。
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綜上所述，彗星試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出較低劑量的CdSO4、K2Cr2O7、Pb(NO4)2、HgCl2誘導(dǎo)的小鼠精原細(xì)胞DNA單鏈斷裂，說(shuō)明這4種金屬化合物都是DNA損傷劑，具有潛在的雄性生殖毒性，同時(shí)也反映出彗星試驗(yàn)在檢測(cè)金屬遺傳毒性方面的敏感性。
本課題受國(guó)家自然科學(xué)基金資助(39670625)
參考文獻(xiàn)
[1] Friberg L,Elinder CG,Kjellstrom T.Environmental health criteria 134 cadimum.Geneva:UNEPILO WHO,1992.97-129.
[2] 夏世均.鉻極其化合物.見(jiàn)：吳執(zhí)中，主編.職業(yè)病.北京：人民衛(wèi)生出版社，1981.62-74.
, http://www.www.srpcoatings.com
[3] Fairbaim DW,Olive PL，O'Neill KL.Comet assay,a comprehensive review.Mutat Res,1995，339:37-59.
[4] 張遵真，衡正昌.用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)鉻和砷化合物的DNA損傷作用.中華預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，1997，31：356-357.
[5] Kirkland DJ,Gallloway SM,Sofuni T.Summay of major conclusions.Mutat Res,1994，312:205-209.
[6] 劉翔，劉世杰.鉻化合物的DNA損傷作用及其機(jī)制.癌變.畸變.突變，1998.60-62.
[7] 張尤恩.鉛污染與健康.見(jiàn)：蔡宏道，主編.現(xiàn)代環(huán)境衛(wèi)生學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1995.731-743.
(收稿日期：1999-06-17), http://www.www.srpcoatings.com