端粒酶抑制劑與腫瘤治療
作者：薛曉暢 張英起
單位：第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032
關(guān)鍵詞：
醫(yī)學(xué)與哲學(xué)001209中圖分類號(hào)：R730.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1002-0772(2000)12-0027-02
端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)比較早，但是只是在近幾年對(duì)它們的研究才相對(duì)重視了起來，尤其是發(fā)現(xiàn)了端粒酶在腫瘤中的相對(duì)特異而廣泛的表達(dá)。以后，人們更是致力于發(fā)現(xiàn)新的特異的端粒酶抑制劑，以期能為腫瘤的治療打開一條通路。
1 端粒酶與腫瘤發(fā)生
1.1 端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)
, 百拇醫(yī)藥 研究發(fā)現(xiàn)在端粒上結(jié)合有兩種蛋白質(zhì)。第一種端粒結(jié)合蛋白(telomere binding protein，TBP)是一種特異結(jié)合在端粒DNA上的蛋白質(zhì)。其中四膜蟲的TBP的晶體結(jié)構(gòu)已比較清楚，它由α、β兩個(gè)亞單位組成，兩者構(gòu)成一溝槽容納并結(jié)合端粒3’的G4T4G4序列。第二種端粒結(jié)合蛋白(Telomere associate proteins)是一類與telomere DNA-binding protein結(jié)合的蛋白質(zhì)，發(fā)揮蛋白與蛋白間的相互作用，組成一個(gè)染色體功能區(qū)域(telosome)。已證明這兩類蛋白質(zhì)對(duì)端粒長(zhǎng)度具有負(fù)調(diào)控作用，并且可能抑制端粒酶活性。由此可見，端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)是一個(gè)多因素協(xié)同作用的結(jié)果。
1.2 端粒酶與腫瘤發(fā)生
端粒酶在維持腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。迄今發(fā)現(xiàn)人體絕大多數(shù)腫瘤近90%有端粒酶的活化表達(dá)，醫(yī)學(xué)界認(rèn)為端粒酶很可能是一種廣泛的腫瘤標(biāo)志。據(jù)此人們提出了一種M1/M2假說，認(rèn)為細(xì)胞只有越過M1(mortality stage 1)和M2(mortality stage 2)期，才能永生化，進(jìn)而發(fā)生腫瘤。
, 百拇醫(yī)藥
端粒酶通過延長(zhǎng)端粒而維持腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖能力。許多細(xì)胞通過端粒酶的表達(dá)下調(diào)或酶裂解而退出細(xì)胞周期。在正常生長(zhǎng)條件下，抑制端粒酶活性，腫瘤來源的細(xì)胞將繼續(xù)分裂并伴隨著端粒的縮短，最終處于靜息狀態(tài)或死亡。雖然關(guān)于端粒酶在腫瘤發(fā)生前還是發(fā)生后激活，人們意見不一，但肯定的是端粒酶活化對(duì)于許多腫瘤的發(fā)生及惡化是必須的。
2 端粒酶活性與腫瘤診斷
近幾年的研究表明，端粒酶幾乎在所有進(jìn)展期腫瘤中都有表達(dá)，它是乳腺癌等發(fā)生的早期指標(biāo)，而且端粒酶活性在某些組織中可作為鑒別良惡性腫瘤的“標(biāo)準(zhǔn)”。在對(duì)胰腺腫瘤、卵巢上皮腫瘤、濾泡性甲狀腺腫瘤等的良惡性鑒別上已取得了比較理想的效果。最近，Sawant等發(fā)現(xiàn)端粒酶的活性是放療效果較理想的監(jiān)測(cè)物。
由于端粒酶活性與腫瘤有較密切的關(guān)系，因此對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)以監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展?fàn)顩r在臨床診斷上是有意義的。但是由于對(duì)于端粒酶的激活究竟是在腫瘤發(fā)生的哪個(gè)階段，尚有爭(zhēng)議。對(duì)于端粒酶與腫瘤大小、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，各家意見也不一致。Wullich等的研究表明，在前列腺癌中，由于端粒酶活性的異質(zhì)化，在診斷中容易產(chǎn)生假陰性，所以，應(yīng)用于臨床尚有一段時(shí)間。
, 百拇醫(yī)藥
3 端粒酶抑制劑與腫瘤治療
3.1反義技術(shù)
反義技術(shù)是一種根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，用生物合成或人工合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段(及其衍生物)封閉或抑制目的基因表達(dá)的技術(shù)。實(shí)施反義技術(shù)的主體是反義核酸片段，包括反義DNA、Ribozyme、反義RNA等。反義核酸應(yīng)具備序列專一性、區(qū)域有效性、穩(wěn)定性、細(xì)胞通透性和藥物學(xué)特性。
1995年Feng等將針對(duì)端粒酶RNA的反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞，觀察到Hela細(xì)胞的端粒酶活性明顯受抑，經(jīng)過20余次分裂后，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，最后死亡。隨后，研究發(fā)現(xiàn)一些反義核酸的衍生物(如PS-ODN)也對(duì)端粒酶活性具有抑制性。
核酶(ribozyme,RZ)是一類具有酶活性的RNA分子，可特異性地與靶RNA結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行切割。Kanazawa等設(shè)計(jì)了一種直接作用于人端粒酶RNA(hTR)的錘頭狀核酶在teloRZ，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人工合成的端粒酶RNA具有專一的切割活性，當(dāng)把teloRZ加入人肝癌細(xì)胞端粒酶提取物中，可有效地抑制端粒酶活性，把該酶用作新的抗腫瘤制劑具有潛在的應(yīng)用前景。
, http://www.www.srpcoatings.com
肽核酸(Peptide nucleic acids，PNAs)是近年來人工合成的一類DNA或RNA分子類似物。它以多肽骨架替換了反義寡核昔酸核糖磷酸骨架，具有與單鏈DNA分子相似的結(jié)構(gòu)特征。PNA仍通過Wason-Crick原則與DNA或RNA配對(duì)結(jié)合，由于其中性骨架與靶序列排斥力小，故親和力更高；又因其既非多肽又非核酸，不易被蛋白酶和核酸酶降解，所以穩(wěn)定性大大提高。上述優(yōu)越性使PNA已成為新一代反義分子被用于腫瘤的治療研究。
3. 2 核苷類似物
核苷類似物是一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，它可以通過逆轉(zhuǎn)錄過程的“鏈終止反應(yīng)”發(fā)揮抑制端粒酶活性的作用。其中的Ara-GTP和ddGTP活性較強(qiáng)，F(xiàn)letcher等報(bào)道核苷類似物7-脫氮-2'-脫氧腺嘌呤核苷酸(7-deaza-dATP)和7-脫氮-2'-脫氧鳥嘌呤核苷酸(7-deaza-dGTP)在端粒合成時(shí)摻入端粒重復(fù)序列中，從而導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，長(zhǎng)度縮短，因此，在端粒酶強(qiáng)陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)中摻入核苷類似物有可能為端粒酶抑制劑設(shè)計(jì)提供新的思路。
, 百拇醫(yī)藥
3.3 分化誘導(dǎo)劑
研究表明，分化不良的腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性高，而終末分化或靜止期己退出細(xì)胞周期的其端粒酶活性明顯下調(diào)。Albanell等認(rèn)為端粒酶活性與細(xì)胞分化程度呈反比關(guān)系。分化誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(RA)、二甲亞砜(DMSO)、l，25-二羥維生素D3均可明顯下調(diào)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60、NB4及人胚胎癌細(xì)胞NTERA-2的端粒酶活性。但也有人認(rèn)為誘導(dǎo)分化劑本身并不具有端粒酶活性抑制作用。
3.4 端粒酶蛋白抗體
端粒酶蛋白組分的克隆成功使得運(yùn)用抗體抑制端粒酶活性成為可能�？顾哪はx蛋白組分p80 的抗體可以特異性的免疫沉淀端粒酶，抑制其活性。人端粒酶相關(guān)蛋白TP1與p80具有很高的同源性，抗p80抗體同樣也能抑制人端粒酶活性。
3.5 蛋白激酶C抑制劑
, http://www.www.srpcoatings.com
蛋白激酶C抑制劑bisindolymaleimide Ⅰ和H-7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞NPC-076端粒酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用，staurosporine產(chǎn)生中等強(qiáng)度的抑制作用，sphingosine的抑制作用較弱。
4 問題與展望
當(dāng)人們剛發(fā)現(xiàn)端粒酶與腫瘤治療的極大相關(guān)性時(shí)，許多學(xué)者都認(rèn)為消滅腫瘤的日子為期不遠(yuǎn)了，但實(shí)際情況卻遠(yuǎn)非如此。端粒酶抑制劑用于腫瘤治療還有許多問題有待解決。
雖然大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都有端粒酶活性，但也有一些為陰性。所以端粒酶抑制劑并不是真正的廣譜抗癌物。而且，除癌細(xì)胞以外，人體的許多正常組織如睪丸、卵巢、胚胎細(xì)胞、生血細(xì)胞、腎細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、成人肝細(xì)胞和外周血細(xì)胞中都有端粒酶的表達(dá)，雖然活性很低，但端粒酶抑制劑也可能對(duì)其造成影響。人體的生殖細(xì)胞為端粒酶強(qiáng)陽性，其端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)期維持在一個(gè)恒定的高水平，以維持種屬的延續(xù)性。如果針對(duì)腫瘤細(xì)胞的端粒酶抑制劑同樣可以進(jìn)入生殖細(xì)胞，使其端粒酶失活，其后果將是嚴(yán)重的。因此在把端粒酶應(yīng)用于臨床治療腫瘤前要對(duì)上述情況進(jìn)行評(píng)估和防范。
, http://www.www.srpcoatings.com
一方面，端粒酶活性與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，對(duì)機(jī)體有害；但另一方面端粒酶對(duì)機(jī)體的許多組織細(xì)胞又具有積極的作用，可以使其保持一定的增殖能力，有延緩機(jī)體衰老的效用。所以，人們?cè)谕ㄟ^滅活端粒酶以達(dá)到治療腫瘤目的的同時(shí)，又想通過活化端粒酶來延長(zhǎng)某些易衰老組織器官的工作年限，從而達(dá)到延長(zhǎng)人類壽命的目的。兩者之間的協(xié)調(diào)是一個(gè)值得考慮和研究的問題。
此外，端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)還受端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控，因此，只單純的考慮端粒酶抑制劑，其在人體內(nèi)的效果還有待探討。
總之，端粒酶抑制劑用于腫瘤治療雖然前景比較樂觀，但還有一段很長(zhǎng)的路要走。只有在弄清楚了端粒酶的全酶結(jié)構(gòu)和端粒酶表達(dá)的基因調(diào)節(jié)，并在端粒酶活性表達(dá)定量測(cè)定技術(shù)的改進(jìn)等問題解決之后，端粒酶抑制劑才有望應(yīng)用于臨床腫瘤診斷和治療。
收稿日期：2000-01-13, http://www.www.srpcoatings.com
單位：第四軍醫(yī)大學(xué)，陜西 西安 710032
關(guān)鍵詞：
醫(yī)學(xué)與哲學(xué)001209中圖分類號(hào)：R730.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1002-0772(2000)12-0027-02
端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)比較早，但是只是在近幾年對(duì)它們的研究才相對(duì)重視了起來，尤其是發(fā)現(xiàn)了端粒酶在腫瘤中的相對(duì)特異而廣泛的表達(dá)。以后，人們更是致力于發(fā)現(xiàn)新的特異的端粒酶抑制劑，以期能為腫瘤的治療打開一條通路。
1 端粒酶與腫瘤發(fā)生
1.1 端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)
, 百拇醫(yī)藥 研究發(fā)現(xiàn)在端粒上結(jié)合有兩種蛋白質(zhì)。第一種端粒結(jié)合蛋白(telomere binding protein，TBP)是一種特異結(jié)合在端粒DNA上的蛋白質(zhì)。其中四膜蟲的TBP的晶體結(jié)構(gòu)已比較清楚，它由α、β兩個(gè)亞單位組成，兩者構(gòu)成一溝槽容納并結(jié)合端粒3’的G4T4G4序列。第二種端粒結(jié)合蛋白(Telomere associate proteins)是一類與telomere DNA-binding protein結(jié)合的蛋白質(zhì)，發(fā)揮蛋白與蛋白間的相互作用，組成一個(gè)染色體功能區(qū)域(telosome)。已證明這兩類蛋白質(zhì)對(duì)端粒長(zhǎng)度具有負(fù)調(diào)控作用，并且可能抑制端粒酶活性。由此可見，端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)是一個(gè)多因素協(xié)同作用的結(jié)果。
1.2 端粒酶與腫瘤發(fā)生
端粒酶在維持腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要的作用。迄今發(fā)現(xiàn)人體絕大多數(shù)腫瘤近90%有端粒酶的活化表達(dá)，醫(yī)學(xué)界認(rèn)為端粒酶很可能是一種廣泛的腫瘤標(biāo)志。據(jù)此人們提出了一種M1/M2假說，認(rèn)為細(xì)胞只有越過M1(mortality stage 1)和M2(mortality stage 2)期，才能永生化，進(jìn)而發(fā)生腫瘤。
, 百拇醫(yī)藥
端粒酶通過延長(zhǎng)端粒而維持腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖能力。許多細(xì)胞通過端粒酶的表達(dá)下調(diào)或酶裂解而退出細(xì)胞周期。在正常生長(zhǎng)條件下，抑制端粒酶活性，腫瘤來源的細(xì)胞將繼續(xù)分裂并伴隨著端粒的縮短，最終處于靜息狀態(tài)或死亡。雖然關(guān)于端粒酶在腫瘤發(fā)生前還是發(fā)生后激活，人們意見不一，但肯定的是端粒酶活化對(duì)于許多腫瘤的發(fā)生及惡化是必須的。
2 端粒酶活性與腫瘤診斷
近幾年的研究表明，端粒酶幾乎在所有進(jìn)展期腫瘤中都有表達(dá)，它是乳腺癌等發(fā)生的早期指標(biāo)，而且端粒酶活性在某些組織中可作為鑒別良惡性腫瘤的“標(biāo)準(zhǔn)”。在對(duì)胰腺腫瘤、卵巢上皮腫瘤、濾泡性甲狀腺腫瘤等的良惡性鑒別上已取得了比較理想的效果。最近，Sawant等發(fā)現(xiàn)端粒酶的活性是放療效果較理想的監(jiān)測(cè)物。
由于端粒酶活性與腫瘤有較密切的關(guān)系，因此對(duì)其活性進(jìn)行檢測(cè)以監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)展?fàn)顩r在臨床診斷上是有意義的。但是由于對(duì)于端粒酶的激活究竟是在腫瘤發(fā)生的哪個(gè)階段，尚有爭(zhēng)議。對(duì)于端粒酶與腫瘤大小、惡性程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系，各家意見也不一致。Wullich等的研究表明，在前列腺癌中，由于端粒酶活性的異質(zhì)化，在診斷中容易產(chǎn)生假陰性，所以，應(yīng)用于臨床尚有一段時(shí)間。
, 百拇醫(yī)藥
3 端粒酶抑制劑與腫瘤治療
3.1反義技術(shù)
反義技術(shù)是一種根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，用生物合成或人工合成的特定互補(bǔ)的DNA或RNA片段(及其衍生物)封閉或抑制目的基因表達(dá)的技術(shù)。實(shí)施反義技術(shù)的主體是反義核酸片段，包括反義DNA、Ribozyme、反義RNA等。反義核酸應(yīng)具備序列專一性、區(qū)域有效性、穩(wěn)定性、細(xì)胞通透性和藥物學(xué)特性。
1995年Feng等將針對(duì)端粒酶RNA的反義質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞，觀察到Hela細(xì)胞的端粒酶活性明顯受抑，經(jīng)過20余次分裂后，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑，最后死亡。隨后，研究發(fā)現(xiàn)一些反義核酸的衍生物(如PS-ODN)也對(duì)端粒酶活性具有抑制性。
核酶(ribozyme,RZ)是一類具有酶活性的RNA分子，可特異性地與靶RNA結(jié)合并對(duì)其進(jìn)行切割。Kanazawa等設(shè)計(jì)了一種直接作用于人端粒酶RNA(hTR)的錘頭狀核酶在teloRZ，發(fā)現(xiàn)其對(duì)人工合成的端粒酶RNA具有專一的切割活性，當(dāng)把teloRZ加入人肝癌細(xì)胞端粒酶提取物中，可有效地抑制端粒酶活性，把該酶用作新的抗腫瘤制劑具有潛在的應(yīng)用前景。
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肽核酸(Peptide nucleic acids，PNAs)是近年來人工合成的一類DNA或RNA分子類似物。它以多肽骨架替換了反義寡核昔酸核糖磷酸骨架，具有與單鏈DNA分子相似的結(jié)構(gòu)特征。PNA仍通過Wason-Crick原則與DNA或RNA配對(duì)結(jié)合，由于其中性骨架與靶序列排斥力小，故親和力更高；又因其既非多肽又非核酸，不易被蛋白酶和核酸酶降解，所以穩(wěn)定性大大提高。上述優(yōu)越性使PNA已成為新一代反義分子被用于腫瘤的治療研究。
3. 2 核苷類似物
核苷類似物是一種逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，它可以通過逆轉(zhuǎn)錄過程的“鏈終止反應(yīng)”發(fā)揮抑制端粒酶活性的作用。其中的Ara-GTP和ddGTP活性較強(qiáng)，F(xiàn)letcher等報(bào)道核苷類似物7-脫氮-2'-脫氧腺嘌呤核苷酸(7-deaza-dATP)和7-脫氮-2'-脫氧鳥嘌呤核苷酸(7-deaza-dGTP)在端粒合成時(shí)摻入端粒重復(fù)序列中，從而導(dǎo)致端粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)，長(zhǎng)度縮短，因此，在端粒酶強(qiáng)陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞端粒結(jié)構(gòu)中摻入核苷類似物有可能為端粒酶抑制劑設(shè)計(jì)提供新的思路。
, 百拇醫(yī)藥
3.3 分化誘導(dǎo)劑
研究表明，分化不良的腫瘤細(xì)胞中端粒酶活性高，而終末分化或靜止期己退出細(xì)胞周期的其端粒酶活性明顯下調(diào)。Albanell等認(rèn)為端粒酶活性與細(xì)胞分化程度呈反比關(guān)系。分化誘導(dǎo)劑全反式維甲酸(RA)、二甲亞砜(DMSO)、l，25-二羥維生素D3均可明顯下調(diào)早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60、NB4及人胚胎癌細(xì)胞NTERA-2的端粒酶活性。但也有人認(rèn)為誘導(dǎo)分化劑本身并不具有端粒酶活性抑制作用。
3.4 端粒酶蛋白抗體
端粒酶蛋白組分的克隆成功使得運(yùn)用抗體抑制端粒酶活性成為可能�？顾哪はx蛋白組分p80 的抗體可以特異性的免疫沉淀端粒酶，抑制其活性。人端粒酶相關(guān)蛋白TP1與p80具有很高的同源性，抗p80抗體同樣也能抑制人端粒酶活性。
3.5 蛋白激酶C抑制劑
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蛋白激酶C抑制劑bisindolymaleimide Ⅰ和H-7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞NPC-076端粒酶活性具有很強(qiáng)的抑制作用，staurosporine產(chǎn)生中等強(qiáng)度的抑制作用，sphingosine的抑制作用較弱。
4 問題與展望
當(dāng)人們剛發(fā)現(xiàn)端粒酶與腫瘤治療的極大相關(guān)性時(shí)，許多學(xué)者都認(rèn)為消滅腫瘤的日子為期不遠(yuǎn)了，但實(shí)際情況卻遠(yuǎn)非如此。端粒酶抑制劑用于腫瘤治療還有許多問題有待解決。
雖然大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都有端粒酶活性，但也有一些為陰性。所以端粒酶抑制劑并不是真正的廣譜抗癌物。而且，除癌細(xì)胞以外，人體的許多正常組織如睪丸、卵巢、胚胎細(xì)胞、生血細(xì)胞、腎細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、成人肝細(xì)胞和外周血細(xì)胞中都有端粒酶的表達(dá)，雖然活性很低，但端粒酶抑制劑也可能對(duì)其造成影響。人體的生殖細(xì)胞為端粒酶強(qiáng)陽性，其端粒長(zhǎng)度長(zhǎng)期維持在一個(gè)恒定的高水平，以維持種屬的延續(xù)性。如果針對(duì)腫瘤細(xì)胞的端粒酶抑制劑同樣可以進(jìn)入生殖細(xì)胞，使其端粒酶失活，其后果將是嚴(yán)重的。因此在把端粒酶應(yīng)用于臨床治療腫瘤前要對(duì)上述情況進(jìn)行評(píng)估和防范。
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一方面，端粒酶活性與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)，對(duì)機(jī)體有害；但另一方面端粒酶對(duì)機(jī)體的許多組織細(xì)胞又具有積極的作用，可以使其保持一定的增殖能力，有延緩機(jī)體衰老的效用。所以，人們?cè)谕ㄟ^滅活端粒酶以達(dá)到治療腫瘤目的的同時(shí)，又想通過活化端粒酶來延長(zhǎng)某些易衰老組織器官的工作年限，從而達(dá)到延長(zhǎng)人類壽命的目的。兩者之間的協(xié)調(diào)是一個(gè)值得考慮和研究的問題。
此外，端粒長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)還受端粒結(jié)合蛋白的調(diào)控，因此，只單純的考慮端粒酶抑制劑，其在人體內(nèi)的效果還有待探討。
總之，端粒酶抑制劑用于腫瘤治療雖然前景比較樂觀，但還有一段很長(zhǎng)的路要走。只有在弄清楚了端粒酶的全酶結(jié)構(gòu)和端粒酶表達(dá)的基因調(diào)節(jié)，并在端粒酶活性表達(dá)定量測(cè)定技術(shù)的改進(jìn)等問題解決之后，端粒酶抑制劑才有望應(yīng)用于臨床腫瘤診斷和治療。
收稿日期：2000-01-13, http://www.www.srpcoatings.com