滅活前后HIV-1生物學(xué)性狀改變的研究
作者:樊衛(wèi)平 陳向偉 李敬云 王紅霞 呂富雙
單位:樊衛(wèi)平(山西醫(yī)科大學(xué) 030001);陳向偉(山西醫(yī)科大學(xué) 030001);李敬云(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所);王紅霞(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所);呂富雙(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)
關(guān)鍵詞:
山西醫(yī)藥雜志000519 S/D法及低pH法是常用的血制品滅活病毒的有效方法。在評(píng)價(jià)S/D法及 低pH法滅活HIV試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)不病變樣品經(jīng)盲目傳代可以傳出病變,說(shuō)明HIV在滅活因素作用 下發(fā)生變異。HIV具有高度的變異性,不同地區(qū)不同機(jī)體,同一機(jī)體不同病程,甚至同一機(jī) 體一次取樣均可分離到不同基因型不同生物學(xué)性狀的HIV株[1]。我們?cè)贛T4細(xì)胞 長(zhǎng)期自然傳代培養(yǎng)HIV,分析HIV包膜基因變異及生物學(xué)性狀改變,獲得體外傳代HIV包膜基 因變異不顯著;病毒感染毒力及病毒產(chǎn)量上升;亞型不變,生物學(xué)性狀相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)論。為 了進(jìn)一步了解滅活作用下HIV生物學(xué)性狀的改變,我們?nèi)◇w外自然傳代的第21代樣品施以S/D 及低丙種球蛋白等滅活因素進(jìn)行了下述研究。
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1 材料和方法
1.1 病毒、細(xì)胞、培養(yǎng)基:病毒為HIV-1 B3亞型(引自美國(guó))經(jīng)實(shí)驗(yàn)室傳至21代,感染毒力8.0 TCID50/mL;細(xì) 胞采用MT4細(xì)胞,系攜HTLV的傳代人T淋巴細(xì)胞(引自日本),細(xì)胞培養(yǎng)基為補(bǔ)加10%熱滅活新 生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),含105 U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素和5 mo l/L Hepes。
1.2 低pH法和S/D法滅活HIV,獲取待檢樣品:低丙球(pH 4)和S/D試劑的配制及滅活試驗(yàn)見(jiàn)文獻(xiàn)[2,3]。對(duì)低pH滅活2 h,S/D滅活30 mi n后不引起MT4細(xì)胞病變但經(jīng)傳代后引起MT4細(xì)胞病變的HIV樣品,由細(xì)胞培養(yǎng)孔轉(zhuǎn)種細(xì)胞培養(yǎng) 瓶擴(kuò)大培養(yǎng),同時(shí)培養(yǎng)滅活前對(duì)照HIV樣品(第21代),于第4日大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí),取上 清及沉積細(xì)胞分別用于病毒感染毒力TCID50 測(cè)定和提取帶毒MT4細(xì)胞核酸。
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1.3 測(cè)定病毒感染毒力:稀釋長(zhǎng)勢(shì)良好的MT4細(xì)胞為4×105/mL,0.1 mL/孔滴96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;取1.2中上清液稀 釋從10-1至10-10,0.1 mL/孔滴上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個(gè)稀釋度平行滴4 孔。37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。于滴定后第3日末補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液50 μL/孔,逐日觀察記 錄細(xì)胞病變狀況至第7日,計(jì)算TCID50。
1.4 PCR擴(kuò)增HIV前DNA包膜基因:取沉積的細(xì)胞用酚-氯仿抽提法提取帶毒MT4細(xì)胞核酸; 依據(jù)文獻(xiàn)[4]合成外側(cè)引物ED3-ED14及內(nèi)側(cè)引物ED33-ED31, 分別進(jìn)行第一輪、 第二 輪PCR。 反應(yīng)條件: 94 ℃ 1 min,55 ℃1 min,72 ℃1 min,3個(gè)循環(huán);94 ℃15 s,55 ℃ 45 s,72 ℃1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增出HIV前DNA包膜基因C2-C3區(qū)及其附 近的500 bp左右核酸片段。1.5%瓊脂糖凝膠電泳確證擴(kuò)增產(chǎn)物正確。
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1.5 異源雙鏈泳動(dòng)分析法(HMA)亞型鑒定分析:在一個(gè)0.5 mL Eppendorf管中加5 μL PCR產(chǎn)物,5 μL對(duì)照質(zhì)粒PCR產(chǎn)物或水對(duì)照。1.15 μL異源雙鏈復(fù)性緩沖液混勻100 ℃水浴3 min,迅速冰浴10 min。上樣于5%非變性丙烯酰 胺凝膠,垂直電泳,恒壓250 V,2.5 h。電泳結(jié)束,將凝膠浸泡于0.5 mg/L的溴化乙啶水 溶液中1 h,紫外燈下觀察結(jié)果。若某一樣品與某一亞型對(duì)照質(zhì)粒形成的異源雙鏈泳動(dòng)速度 最快,則可確定該樣品為相應(yīng)亞型。HIV標(biāo)準(zhǔn)亞型質(zhì)粒由衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心惠贈(zèng) 。
2 結(jié) 果
2.1 病毒感染毒力TCID50的測(cè)定結(jié)果:滅活作用前樣品(21代)及S/D法、低pH法滅活作用后樣品病毒感染毒力測(cè)定結(jié)果分別為8.0 、8.4、8.2 TCID50/mL。
2.2 各樣品C2-C3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果:各樣品PCR產(chǎn)物與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量的616 bp接近而低于6 16 bp,說(shuō)明擴(kuò)增結(jié)果正確。見(jiàn)圖1。
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2.3 異源雙鏈泳動(dòng)分析法(HMA)法亞型鑒定結(jié)果:見(jiàn)圖2。
1 NDA標(biāo)準(zhǔn)分子量(PBR322/TaqI)2 陰性(水)對(duì)照 3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒B3
4 滅活前(21代)樣品 5 S/D滅活后樣品 6 酸滅活后樣品
圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
1~8依次為S/D滅活后樣品與對(duì)照質(zhì)粒A1,B2,B3,C1,D3,E1,E2
及陰性對(duì)照(水)雜交結(jié)果 9~16依次為酸滅活后樣品
與對(duì)照質(zhì)粒A1,B2,B3,C1,D3,E1,E2及陰性對(duì)照(水)雜交結(jié)果,結(jié)果均為B3亞型(滅活前也為B3亞型)
, 百拇醫(yī)藥
圖2 低pH及S/D滅活后樣品擴(kuò)增片段HMA亞型鑒定結(jié)果
3 討 論
由結(jié)果可知經(jīng)S/D及酸滅活作用并傳代后HIV感染毒力不會(huì)下降,反而,均有上升趨勢(shì);基因 亞型不變,均為B3亞型(此后核苷酸序列測(cè)定證明確為B3亞型)。結(jié)果明顯支持此前體外連續(xù) 傳代培養(yǎng)HIV獲得的結(jié)論?梢哉J(rèn)為,不論是在MT4細(xì)胞自然傳代,還是施加滅活因素傳代 ,HIV感染毒力在一定范圍內(nèi)上升,基因型別不變,即體外傳代HIV生物學(xué)性狀相對(duì)穩(wěn)定。此 結(jié)果提示通過(guò)體外傳代獲取減毒活疫苗的可能性不大。分析其感染毒力上升的原因,可能是 :①去除滅活因素作用并已適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境后,在體外無(wú)免疫壓力作用下,病毒本身固 有的高復(fù)制能力得以充分表現(xiàn)[5,6];②經(jīng)滅活作用后適應(yīng)性及毒力更強(qiáng)的變異株 得以繁殖成為優(yōu)勢(shì)株。
異源雙鏈泳動(dòng)分析法是世界衛(wèi)生組織推薦的鑒定HIV基因亞型的方法[4],其主要原 理是不同來(lái)源的相同大小片段的雙鏈DNA經(jīng)過(guò)加熱變性和低溫復(fù)性,可形成同源雙鏈二聚體 和異源雙鏈二聚體。異源二聚體因兩條單鏈的來(lái)源不同(樣品和對(duì)照質(zhì)粒)存在或多或少的錯(cuò) 配對(duì)或不配對(duì)堿基,形成鏈內(nèi)凸起的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在分辨率高的丙烯酰胺凝膠電泳中,泳動(dòng)速 度低于同源二聚體,鏈內(nèi)錯(cuò)配對(duì)或不配對(duì)堿基越多,泳動(dòng)越慢。如某樣品與某對(duì)照質(zhì)粒形成 的異源雙鏈相對(duì)泳動(dòng)最快,最接近于同源二聚體,則確定該樣品為該對(duì)照質(zhì)粒的相應(yīng)亞型。 本實(shí)驗(yàn)再次證明異源雙鏈泳動(dòng)分析法是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的HIV亞型鑒定分析方 法[4]。
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本研究有待于對(duì)兩滅活法作用后的變異株再施以同樣的滅活因素,觀察其是否確已對(duì)相應(yīng)的 滅活因素產(chǎn)生耐受,并進(jìn)一步分析其感染毒力等變化,后續(xù)工作尚在進(jìn)行中。
(本文圖1~2見(jiàn)插頁(yè)圖第2頁(yè))
作者簡(jiǎn)介:樊衛(wèi)平,女,1967年4月生,講師,山西醫(yī)科大學(xué),030001
參考文獻(xiàn)
1.Chaix-Baudier ML,Chappey C,Burgard M,et al.First case of moth er-to-infant HIV type 1 group O transmission and evolution of C2V3 sequences i n the infected child.AIDS Res Hum Retroviruses,1998,14:15
, http://www.www.srpcoatings.com
2.周鐵群,邱平,王劍鋒,等.對(duì)血液制品S/D病毒滅活方法的驗(yàn)證.中 國(guó)生物制品學(xué)雜志,1995,8(3):107
3.周鐵群,邱平,王劍鋒,等.對(duì)10廠家低pH靜脈注射用人丙種球蛋白病 毒滅活工藝的驗(yàn)證.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,1999,12(2):106
4.Delwart EL.Genetic subtyping of human immunodeficiency vir us using a heteroduplex mobility assay.PCR Meth Appl,1995,4:s202
5.Kusumi KB,Conway S,Cunningham,et al.Human immunodefi-
ciency virus type 1 envelope gene structure and diversity in vivo and afte r cocultivation in vitro.J Virol,1992,68:875
6.Tersmette MRA,Gruters F,de Wolf RE,et al.Evidence for a role o f virulent HIV variants in the pathogenesis of acquired immunodeficiency syndrom e:studies on sequential HIV isolates.J Virol,1989,63:2118
(收稿日期:2000-03-30), 百拇醫(yī)藥
單位:樊衛(wèi)平(山西醫(yī)科大學(xué) 030001);陳向偉(山西醫(yī)科大學(xué) 030001);李敬云(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所);王紅霞(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所);呂富雙(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所)
關(guān)鍵詞:
山西醫(yī)藥雜志000519 S/D法及低pH法是常用的血制品滅活病毒的有效方法。在評(píng)價(jià)S/D法及 低pH法滅活HIV試驗(yàn)中,發(fā)現(xiàn)不病變樣品經(jīng)盲目傳代可以傳出病變,說(shuō)明HIV在滅活因素作用 下發(fā)生變異。HIV具有高度的變異性,不同地區(qū)不同機(jī)體,同一機(jī)體不同病程,甚至同一機(jī) 體一次取樣均可分離到不同基因型不同生物學(xué)性狀的HIV株[1]。我們?cè)贛T4細(xì)胞 長(zhǎng)期自然傳代培養(yǎng)HIV,分析HIV包膜基因變異及生物學(xué)性狀改變,獲得體外傳代HIV包膜基 因變異不顯著;病毒感染毒力及病毒產(chǎn)量上升;亞型不變,生物學(xué)性狀相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)論。為 了進(jìn)一步了解滅活作用下HIV生物學(xué)性狀的改變,我們?nèi)◇w外自然傳代的第21代樣品施以S/D 及低丙種球蛋白等滅活因素進(jìn)行了下述研究。
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1 材料和方法
1.1 病毒、細(xì)胞、培養(yǎng)基:病毒為HIV-1 B3亞型(引自美國(guó))經(jīng)實(shí)驗(yàn)室傳至21代,感染毒力8.0 TCID50/mL;細(xì) 胞采用MT4細(xì)胞,系攜HTLV的傳代人T淋巴細(xì)胞(引自日本),細(xì)胞培養(yǎng)基為補(bǔ)加10%熱滅活新 生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司),含105 U/L青霉素,100 mg/L鏈霉素和5 mo l/L Hepes。
1.2 低pH法和S/D法滅活HIV,獲取待檢樣品:低丙球(pH 4)和S/D試劑的配制及滅活試驗(yàn)見(jiàn)文獻(xiàn)[2,3]。對(duì)低pH滅活2 h,S/D滅活30 mi n后不引起MT4細(xì)胞病變但經(jīng)傳代后引起MT4細(xì)胞病變的HIV樣品,由細(xì)胞培養(yǎng)孔轉(zhuǎn)種細(xì)胞培養(yǎng) 瓶擴(kuò)大培養(yǎng),同時(shí)培養(yǎng)滅活前對(duì)照HIV樣品(第21代),于第4日大多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí),取上 清及沉積細(xì)胞分別用于病毒感染毒力TCID50 測(cè)定和提取帶毒MT4細(xì)胞核酸。
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1.3 測(cè)定病毒感染毒力:稀釋長(zhǎng)勢(shì)良好的MT4細(xì)胞為4×105/mL,0.1 mL/孔滴96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;取1.2中上清液稀 釋從10-1至10-10,0.1 mL/孔滴上述96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每個(gè)稀釋度平行滴4 孔。37 ℃、5% CO2孵箱培養(yǎng)。于滴定后第3日末補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)液50 μL/孔,逐日觀察記 錄細(xì)胞病變狀況至第7日,計(jì)算TCID50。
1.4 PCR擴(kuò)增HIV前DNA包膜基因:取沉積的細(xì)胞用酚-氯仿抽提法提取帶毒MT4細(xì)胞核酸; 依據(jù)文獻(xiàn)[4]合成外側(cè)引物ED3-ED14及內(nèi)側(cè)引物ED33-ED31, 分別進(jìn)行第一輪、 第二 輪PCR。 反應(yīng)條件: 94 ℃ 1 min,55 ℃1 min,72 ℃1 min,3個(gè)循環(huán);94 ℃15 s,55 ℃ 45 s,72 ℃1 min,32個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增出HIV前DNA包膜基因C2-C3區(qū)及其附 近的500 bp左右核酸片段。1.5%瓊脂糖凝膠電泳確證擴(kuò)增產(chǎn)物正確。
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1.5 異源雙鏈泳動(dòng)分析法(HMA)亞型鑒定分析:在一個(gè)0.5 mL Eppendorf管中加5 μL PCR產(chǎn)物,5 μL對(duì)照質(zhì)粒PCR產(chǎn)物或水對(duì)照。1.15 μL異源雙鏈復(fù)性緩沖液混勻100 ℃水浴3 min,迅速冰浴10 min。上樣于5%非變性丙烯酰 胺凝膠,垂直電泳,恒壓250 V,2.5 h。電泳結(jié)束,將凝膠浸泡于0.5 mg/L的溴化乙啶水 溶液中1 h,紫外燈下觀察結(jié)果。若某一樣品與某一亞型對(duì)照質(zhì)粒形成的異源雙鏈泳動(dòng)速度 最快,則可確定該樣品為相應(yīng)亞型。HIV標(biāo)準(zhǔn)亞型質(zhì)粒由衛(wèi)生部艾滋病預(yù)防與控制中心惠贈(zèng) 。
2 結(jié) 果
2.1 病毒感染毒力TCID50的測(cè)定結(jié)果:滅活作用前樣品(21代)及S/D法、低pH法滅活作用后樣品病毒感染毒力測(cè)定結(jié)果分別為8.0 、8.4、8.2 TCID50/mL。
2.2 各樣品C2-C3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果:各樣品PCR產(chǎn)物與DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量的616 bp接近而低于6 16 bp,說(shuō)明擴(kuò)增結(jié)果正確。見(jiàn)圖1。
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2.3 異源雙鏈泳動(dòng)分析法(HMA)法亞型鑒定結(jié)果:見(jiàn)圖2。
1 NDA標(biāo)準(zhǔn)分子量(PBR322/TaqI)2 陰性(水)對(duì)照 3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒B3
4 滅活前(21代)樣品 5 S/D滅活后樣品 6 酸滅活后樣品
圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果
1~8依次為S/D滅活后樣品與對(duì)照質(zhì)粒A1,B2,B3,C1,D3,E1,E2
及陰性對(duì)照(水)雜交結(jié)果 9~16依次為酸滅活后樣品
與對(duì)照質(zhì)粒A1,B2,B3,C1,D3,E1,E2及陰性對(duì)照(水)雜交結(jié)果,結(jié)果均為B3亞型(滅活前也為B3亞型)
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圖2 低pH及S/D滅活后樣品擴(kuò)增片段HMA亞型鑒定結(jié)果
3 討 論
由結(jié)果可知經(jīng)S/D及酸滅活作用并傳代后HIV感染毒力不會(huì)下降,反而,均有上升趨勢(shì);基因 亞型不變,均為B3亞型(此后核苷酸序列測(cè)定證明確為B3亞型)。結(jié)果明顯支持此前體外連續(xù) 傳代培養(yǎng)HIV獲得的結(jié)論?梢哉J(rèn)為,不論是在MT4細(xì)胞自然傳代,還是施加滅活因素傳代 ,HIV感染毒力在一定范圍內(nèi)上升,基因型別不變,即體外傳代HIV生物學(xué)性狀相對(duì)穩(wěn)定。此 結(jié)果提示通過(guò)體外傳代獲取減毒活疫苗的可能性不大。分析其感染毒力上升的原因,可能是 :①去除滅活因素作用并已適應(yīng)體外培養(yǎng)環(huán)境后,在體外無(wú)免疫壓力作用下,病毒本身固 有的高復(fù)制能力得以充分表現(xiàn)[5,6];②經(jīng)滅活作用后適應(yīng)性及毒力更強(qiáng)的變異株 得以繁殖成為優(yōu)勢(shì)株。
異源雙鏈泳動(dòng)分析法是世界衛(wèi)生組織推薦的鑒定HIV基因亞型的方法[4],其主要原 理是不同來(lái)源的相同大小片段的雙鏈DNA經(jīng)過(guò)加熱變性和低溫復(fù)性,可形成同源雙鏈二聚體 和異源雙鏈二聚體。異源二聚體因兩條單鏈的來(lái)源不同(樣品和對(duì)照質(zhì)粒)存在或多或少的錯(cuò) 配對(duì)或不配對(duì)堿基,形成鏈內(nèi)凸起的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在分辨率高的丙烯酰胺凝膠電泳中,泳動(dòng)速 度低于同源二聚體,鏈內(nèi)錯(cuò)配對(duì)或不配對(duì)堿基越多,泳動(dòng)越慢。如某樣品與某對(duì)照質(zhì)粒形成 的異源雙鏈相對(duì)泳動(dòng)最快,最接近于同源二聚體,則確定該樣品為該對(duì)照質(zhì)粒的相應(yīng)亞型。 本實(shí)驗(yàn)再次證明異源雙鏈泳動(dòng)分析法是一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、廉價(jià)的HIV亞型鑒定分析方 法[4]。
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本研究有待于對(duì)兩滅活法作用后的變異株再施以同樣的滅活因素,觀察其是否確已對(duì)相應(yīng)的 滅活因素產(chǎn)生耐受,并進(jìn)一步分析其感染毒力等變化,后續(xù)工作尚在進(jìn)行中。
(本文圖1~2見(jiàn)插頁(yè)圖第2頁(yè))
作者簡(jiǎn)介:樊衛(wèi)平,女,1967年4月生,講師,山西醫(yī)科大學(xué),030001
參考文獻(xiàn)
1.Chaix-Baudier ML,Chappey C,Burgard M,et al.First case of moth er-to-infant HIV type 1 group O transmission and evolution of C2V3 sequences i n the infected child.AIDS Res Hum Retroviruses,1998,14:15
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2.周鐵群,邱平,王劍鋒,等.對(duì)血液制品S/D病毒滅活方法的驗(yàn)證.中 國(guó)生物制品學(xué)雜志,1995,8(3):107
3.周鐵群,邱平,王劍鋒,等.對(duì)10廠家低pH靜脈注射用人丙種球蛋白病 毒滅活工藝的驗(yàn)證.中國(guó)生物制品學(xué)雜志,1999,12(2):106
4.Delwart EL.Genetic subtyping of human immunodeficiency vir us using a heteroduplex mobility assay.PCR Meth Appl,1995,4:s202
5.Kusumi KB,Conway S,Cunningham,et al.Human immunodefi-
ciency virus type 1 envelope gene structure and diversity in vivo and afte r cocultivation in vitro.J Virol,1992,68:875
6.Tersmette MRA,Gruters F,de Wolf RE,et al.Evidence for a role o f virulent HIV variants in the pathogenesis of acquired immunodeficiency syndrom e:studies on sequential HIV isolates.J Virol,1989,63:2118
(收稿日期:2000-03-30), 百拇醫(yī)藥