TGF-β1對(duì)人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣影響的激光共聚焦顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察
作者：王景杰 牛忠英 倪龍興 王春梅
單位：王景杰(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；牛忠英(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；倪龍興(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；王春梅(第四軍醫(yī)大學(xué)電鏡中心)
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；牙髓細(xì)胞； 激光掃描共聚焦顯微鏡
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志000307〔摘要〕 目的：探討TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣〔(Ca2 + )i〕的關(guān)系。方法：體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞經(jīng)鈣熒光指示劑Fluo-3負(fù)載后，用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定TGF-β1影響前后的人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣隨時(shí)間變化情況。結(jié)果：TGF-β1(0.1 ng/L)使人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣先升高后降低，最后維持 在比加藥前稍高的靜息鈣水平上。結(jié)論：通過TGF-β可引起牙髓細(xì) 胞內(nèi)Ca2+水平的顯著變化，證明Ca2+參與了人牙髓細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過 程并參與將信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)。
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中圖分類號(hào)：R781.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
文章編號(hào)：1001-3733(2000)03-0192-04
A dynamic observation of the effects of TGF-β1 on intracellular calcium in
cultured human pulp cells with laser scanning confocal microscopy
Wang Jingjie,Niu Zhongying, Ni Longxing.
(Stomatological College,Fourth Mili tary Medical University,Xi'an 710032)
, 百拇醫(yī)藥
〔Abstract〕Objective: To investigate the relationship between TGF- β1 message tr ansduction process and changes of intracellular calcium in human pulp cells. Methods: Human pulp cells were cultured with TGF -β1 and intracellular calcium level was measured with t he fluorescent Ca2+ indicator Fluo-3 and lase r scanning confocal microscopy. Results: After being treat ed with TGF-β1(0.1 ng/L), intracellular calcium in human pulp cell increased (P< 0.01) and then decreased (P<0.05). At last, it came to a higher level of res ting intracellular calcium. Conclusio n : Calcium participates in the process of TGF-β1 message transdu ction.
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Key Words Transforming grouth facfor beta,Dental pulp;Cell; Las er scanning confocal microscopy(LSCM)▲
鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使參與諸如肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及細(xì)胞增殖與分 化等多種重要生理活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化是細(xì)胞重要的信息系統(tǒng)，細(xì)胞在外界或不同 生理、病理狀態(tài)下胞內(nèi)鈣離子濃度都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。
牙髓細(xì)胞或部分牙髓細(xì)胞具有分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞及生成牙本質(zhì)的潛能，牙髓細(xì)胞在其分化 、增殖及礦化過程中受包括多種生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多因素的調(diào)節(jié)，各種因素引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的 不同變化是牙髓細(xì)胞增殖、分化以及礦化的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming gro wth factor-β,TGF-β)對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖具有雙向調(diào)節(jié)功能〔1,2〕，在牙本質(zhì) 修復(fù)過程中 對(duì)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化有重要促進(jìn)作用〔3〕。本研究采用體外培養(yǎng)牙 髓細(xì)胞， 利用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope,LSCM)動(dòng)態(tài)觀察TGFβ1 對(duì)牙 髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，為進(jìn)一步探明TGFβ1對(duì)牙髓細(xì)胞調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提 供依據(jù)，為研究牙髓細(xì)胞分化及牙本質(zhì)形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
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1 材料和方法
1.1 試劑
D-Hank液(g/L):NaCl 8.00， KCl 0.40, Na2HPO·4.12H2O 0.12, KH2PO4 0.06 , D-Glucose 1.00,NaHCO3 0.35,采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┖统兯?18.2 MΩcm)配制。Fluo -3/AM系美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品；胰蛋白酶由華美生物工程公司購(gòu)得；小 牛 血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供；DMEM培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO公司提供，TGF-β 1系美國(guó)PROMEGA公司產(chǎn)品。
1.2 牙髓細(xì)胞培養(yǎng)
選13～20歲因正畸或阻生拔除的完整新鮮恒牙(第一前磨牙及第三磨牙)，劈冠取出牙髓組 織，剪成1 mm3碎塊，鋪于培養(yǎng)瓶底，以含體積分?jǐn)?shù)(φ)為10%胎牛血清(FBS)的DMEM培 養(yǎng)液，φ(CO2為5%，φ(空氣)=95%，飽和濕度，37 ℃孵育做原代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的第 4代牙髓細(xì)胞接種在特制培養(yǎng)皿中 ，接種濃度2.5×108/L，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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1.3 實(shí)驗(yàn)分組(每組復(fù)種兩個(gè)培養(yǎng)皿)
對(duì)照組：φ(FBS)=10%的DMEM
實(shí)驗(yàn)組：用φ(FBS)=10%的DMEM配制的質(zhì)量濃度為0.1 ng/L的TGF-β1溶液
1.4 牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定
1.4.1 測(cè)定原理 Fluo-3能特異性地與鈣離子結(jié)合，并在一定 波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，且與鈣離子結(jié)合后其熒光光譜發(fā)生變化，其熒光強(qiáng)度與Ca 2+濃 度成正比，因而可用于觀察Ca2+動(dòng)態(tài)變化〔4〕。但Fluo-3為極性大的酸性化 合物，難以進(jìn)入 細(xì)胞，而當(dāng)其結(jié)合上親酯的乙酰羥甲基酯成為脂溶性的Fluo-3/AM，再與細(xì)胞孵育時(shí)，便很 容易透過細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)的非特異性酯酶將其脂解脫去脂基生成游離的Fluo-3。
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1.4.2 D-Hank液(pH7.4)洗滌標(biāo)本2次后，于37 ℃避光條件下用D-Hank液稀釋的Fluo -3/AM(10 μmol/L)荷載，40 min后再用D-Hank液洗滌細(xì)胞3次，最后保留少許細(xì)胞外 D-Hank液平衡10 min〔5〕，LSCM下觀察。
1.4.3 激光共聚焦圖像 LSCM能對(duì)活細(xì)胞內(nèi)部的離子分 布及隨時(shí)間的變化進(jìn)行成像及測(cè)量。本實(shí)驗(yàn)使用的是BIO-RAD公司的MRC-1024 LSCM。在 觀察C a2+快速變化時(shí)，可選線掃方式，其采樣頻率為488 Hz，與Ca2+結(jié)合的Fluo-3 可以被488 nm的 氬離子激光激發(fā)，可在525 nm處探測(cè)到熒光發(fā)射，其熒光強(qiáng)度的變化可指示胞內(nèi)游離鈣濃度 的相對(duì)變化。
1.4.4 加藥 在LSCM下選好細(xì)胞后，用微量加藥器將實(shí)驗(yàn)條件要求的試劑滴加在培養(yǎng)皿 中，試劑擴(kuò)散后進(jìn)行觀察
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1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理
數(shù)據(jù)均用
±s 表示，數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS軟件。
2 結(jié) 果
2.1 加藥前實(shí)驗(yàn)組(n=8)與對(duì)照組(n=6)牙髓細(xì)胞〔Ca2+〕i水平無明顯 差異：Ca2+含量少、熒 光強(qiáng)度弱，分布較均勻(圖1)。加藥后實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間明顯變化而對(duì)照組無明顯變 化(圖2,3)。
圖1 實(shí)驗(yàn)組加藥前牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣含量(LSCM，×400)
2.2 實(shí)驗(yàn)組牙髓細(xì)胞加入TGFβ(0.1 ng/L)后10 s，胞內(nèi)Ca2+開始上升，經(jīng)18 s后達(dá) 最高峰，此時(shí)熒光最強(qiáng)且分布不均，其中核周熒光最強(qiáng)(圖4)持續(xù)50 s后開始下降，經(jīng)45 s后鈣離子濃度趨于平穩(wěn)，但其水平仍稍高于加藥前靜息鈣水平(圖5)。其中，實(shí)驗(yàn)組熒光 強(qiáng)度最大(4.6±0.02)時(shí)所代表的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平與對(duì)照組(1.5±0.01)具有顯著差異 (P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)組加藥后靜息熒光強(qiáng)度(2.8±0.01)所代表的胞內(nèi)Ca2+水平 與對(duì)照組(1.5±0.01)Ca2+水平也差別顯著(P<0.01)。
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圖2 TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣的影響(
為加藥處)
圖中下線為基線，上兩條線是兩個(gè)不同細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化線
圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣隨時(shí)間變化曲線(為加藥處)
3 討 論
鈣離子既是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使，又是骨、牙齒等硬組織的基本成分，其沉積引發(fā)的礦化是在嚴(yán)格的細(xì)胞控制下 完成的。研究表明，體外培養(yǎng)牙髓 細(xì)胞具有潛在的分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及發(fā)生礦化的能力〔6〕，而牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2 +水平能夠反應(yīng)出細(xì)胞的狀態(tài)、藥物、胞外環(huán)境對(duì)細(xì)胞的 影響〔7〕。因此，研究體 外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化對(duì)研究牙髓細(xì)胞分化的誘導(dǎo)及礦化具有重要意義。
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圖4 牙髓細(xì)胞加入TGF-β1 28 s后細(xì)胞內(nèi)鈣英光顯示圖(LSCM，×400)
圖5 牙髓細(xì)胞加入TGFβ1 2min后〔Ca2+〕i水平
(LSCM，×400)
3.1 關(guān)于本研究的測(cè)量技術(shù)
目前測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的方法有：①鈣離子選擇微電極法，但該方法對(duì)于較小細(xì)胞內(nèi) 的操作較難且微電極反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)；②放射示蹤法，該方法可定性定量分析細(xì)胞內(nèi)外Ca 2+變化，主要 用于測(cè)定跨膜Ca2+流動(dòng)及代謝動(dòng)力學(xué)變化，但對(duì)細(xì)胞靜息Ca2+濃度測(cè)定操作復(fù) 雜且效果不理想；③熒光標(biāo)記示蹤法，由于細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑的發(fā)現(xiàn)和其性能的不斷完善 ， 該方法日見其優(yōu)越性。Fluo-3作為第3代熒光指示劑，是唯一在可見光區(qū)有激發(fā)峰的熒光 劑 ，可以避免紫外光對(duì)細(xì)胞的損害和激發(fā)自發(fā)熒光傾向，它與Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加 40倍，因此在觀察Ca2+的空間分布和快速時(shí)間變化方面，F(xiàn)luo-3的性能是目前最好 的 ，加之有激光共聚焦掃描技術(shù)配合，使細(xì)胞內(nèi)甚至細(xì)胞器內(nèi)Ca2+的空間和時(shí)間變化的 測(cè)定更加完善。
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3.2 TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響
通常情況下，由于細(xì)胞內(nèi)存在豐富的鈣平衡系統(tǒng)，故可維持比細(xì)胞外低5000～10000倍的Ca 2+ 濃度〔9〕，但當(dāng)細(xì)胞受到不同外界刺激時(shí)其細(xì)胞內(nèi)鈣會(huì)發(fā)生一定的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示， TGF-β1可使牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+先升高后降低。一般來說，細(xì)胞內(nèi)鈣升高機(jī) 制 有以下三種：①通過IP3引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體中Ca2+釋放入細(xì)胞漿；②神經(jīng)沖 動(dòng)使 電壓依賴性鈣通道開放，Ca2+內(nèi)流；③通過cAMP激活A(yù)PK使鈣通道磷酸化而變構(gòu)開放〔8〕。而TGF-β的3種受體都含有絲氨酸-蘇氨酸序列，并且TGF-βRI和TGF-βRII 具有內(nèi)在絲氨酸-蘇氨酸激酶活性〔9〕。 因此，TGF-β作用的可能機(jī)制是TGF-β與其受體結(jié)合后，受體被激活，從而活化PLC，后 者可 催化PIP2分解為DG和IP3，IP3作為第二信使作用于細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)上的IP3受體，釋放C a2+入細(xì) 胞漿。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+枯竭后能激活細(xì)胞膜上的鈣通道引發(fā)Ca2+持續(xù)內(nèi)流而 使〔Ca2+〕i升高。
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通常一過性的細(xì)胞內(nèi)鈣升高可以傳遞信息，并可引發(fā)一系列有重要生理意義的生物學(xué) 效應(yīng)，而慢性持續(xù)性的細(xì)胞內(nèi)鈣升高則會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生鈣毒性。因此，為了保持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài) ，細(xì)胞會(huì)動(dòng)用豐富的鈣平衡系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平。調(diào)節(jié)Ca2+平衡的相關(guān)蛋白有鈣泵 (Ca2+ ATP酶)、Ca2+通道蛋白、Na+/Ca2+交換蛋白、Ca2+轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及眾多 的鈣結(jié)合蛋白。TGF-β可使牙髓細(xì)胞ALP活性升高〔9〕，促進(jìn) ALP水 解ATP為運(yùn)輸Ca2+、PO42-提供能量， 因胞內(nèi)鈣濃度升高而活化的Ca2+泵利用ATP水解產(chǎn)生的能量、Na+/Ca2+交換 蛋白活 化利用Na+順濃度梯度入胞的能量將Ca2+逆濃度差泵出細(xì)胞外，從而使〔C a2+〕i降低。
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本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1使細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)后維持在比 加藥前稍高 的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上(P<0.01)，提示TGF-β作用于牙髓細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)C a2+經(jīng)各種信號(hào)分 子調(diào)節(jié)而波動(dòng)后，細(xì)胞可重新建立新的鈣平衡，即在無細(xì)胞鈣毒性前提下提高了細(xì)胞內(nèi)靜息 鈣水平，而這種變化對(duì)于牙髓細(xì)胞分化具有重要意義。此外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，Ca2+ 變化有空間特異性，靜息狀態(tài)下胞質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度高于核內(nèi)，TGF-β1作用后細(xì)胞核周Ca 2+升高 幅度較大，在核周形成明顯的不延續(xù)的周暈，這可能是由于核區(qū)存在某些鈣結(jié)合物，或者有 Ca2+轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)。詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
4 結(jié) 論
TGFβ能引起牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的顯著變化， TGF-β使胞漿及胞核 內(nèi)的〔Ca2+〕i均經(jīng)歷先升高后降低的變化，并維持在比加藥前稍高的靜息Ca2 +水平上。證明Ca 2+參與了TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并參與將信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)�！�
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本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 批準(zhǔn)號(hào) 39870789
參考文獻(xiàn)
[1]Nakashima M. The effects of growth factors on DNA synthesis,proteoglycan synthesis and alkaline phosphatase activity in bovine dental pulp cell. Arch Or al Biol,1992,37:231
[2]Shirakawa M, Shiba H, Nakanishi K, et al. Transforming growth factor-β1 r educe alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proliferation i n cultures of human pulp cells. J Dent Res,1994,73:1509
, http://www.www.srpcoatings.com
[3]Toyono T, Nakashima M, Kuhara S.et al Temporal changes in expression of tr ansforming growth factor-beta superfamily members and their receptors during b ovine preo dontoblast differentiation in vitro. Arch Oral Biol,1997,42(7): 481
[4]Tsien RY. Fluorecence measurement and photochemical manipulation of cytosoli c calcium. TINS,1988,11(10):419
[5]Satoh H, Blatter LA, Bers DM. Effects of 〔Ca2+〕i SR Ca2+ load ,a nd rest on Ca2+ spark frequency in ventricular myocytes. Am J Physiol,1997 ,272(Heart Circ Physiol 41):H657
, http://www.www.srpcoatings.com
[6]Tsukamoto Y,Fukutani S,Shin-ike T,et al. Mineralized nodule formation by c ultures of human dental pulp-derived fibroblast. Arch Oral Biol,1992,37(12):104 5
[7]Mary BK. Regulation of neuronal function by calcium. TINS,1989,12(11):417
[8]顧天爵主編. 生物化學(xué).第4版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1996.321
[9]Takemi T, Moustakas A, Lin HY, et al. Molecular characterization of a type I serine-theronine kinase receptor for TGFβand activin in the rat pituitary tum or cell line GH3. Exp Cell Res,1995,216:208
收稿日期：2000-01-31
修稿日期：2000-02-28, 百拇醫(yī)藥
單位：王景杰(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；牛忠英(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；倪龍興(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科 710032)；王春梅(第四軍醫(yī)大學(xué)電鏡中心)
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；牙髓細(xì)胞； 激光掃描共聚焦顯微鏡
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志000307〔摘要〕 目的：探討TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程與人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣〔(Ca2 + )i〕的關(guān)系。方法：體外培養(yǎng)人牙髓細(xì)胞經(jīng)鈣熒光指示劑Fluo-3負(fù)載后，用激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定TGF-β1影響前后的人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣隨時(shí)間變化情況。結(jié)果：TGF-β1(0.1 ng/L)使人牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣先升高后降低，最后維持 在比加藥前稍高的靜息鈣水平上。結(jié)論：通過TGF-β可引起牙髓細(xì) 胞內(nèi)Ca2+水平的顯著變化，證明Ca2+參與了人牙髓細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過 程并參與將信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)。
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A dynamic observation of the effects of TGF-β1 on intracellular calcium in
cultured human pulp cells with laser scanning confocal microscopy
Wang Jingjie,Niu Zhongying, Ni Longxing.
(Stomatological College,Fourth Mili tary Medical University,Xi'an 710032)
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〔Abstract〕Objective: To investigate the relationship between TGF- β1 message tr ansduction process and changes of intracellular calcium in human pulp cells. Methods: Human pulp cells were cultured with TGF -β1 and intracellular calcium level was measured with t he fluorescent Ca2+ indicator Fluo-3 and lase r scanning confocal microscopy. Results: After being treat ed with TGF-β1(0.1 ng/L), intracellular calcium in human pulp cell increased (P< 0.01) and then decreased (P<0.05). At last, it came to a higher level of res ting intracellular calcium. Conclusio n : Calcium participates in the process of TGF-β1 message transdu ction.
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鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使參與諸如肌肉收縮、神經(jīng)傳導(dǎo)以及細(xì)胞增殖與分 化等多種重要生理活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化是細(xì)胞重要的信息系統(tǒng)，細(xì)胞在外界或不同 生理、病理狀態(tài)下胞內(nèi)鈣離子濃度都會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。
牙髓細(xì)胞或部分牙髓細(xì)胞具有分化成成牙本質(zhì)細(xì)胞及生成牙本質(zhì)的潛能，牙髓細(xì)胞在其分化 、增殖及礦化過程中受包括多種生長(zhǎng)因子在內(nèi)的多因素的調(diào)節(jié)，各種因素引起的細(xì)胞內(nèi)鈣的 不同變化是牙髓細(xì)胞增殖、分化以及礦化的重要環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming gro wth factor-β,TGF-β)對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖具有雙向調(diào)節(jié)功能〔1,2〕，在牙本質(zhì) 修復(fù)過程中 對(duì)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞分化有重要促進(jìn)作用〔3〕。本研究采用體外培養(yǎng)牙 髓細(xì)胞， 利用激光共聚焦顯微鏡(Laser scanning confocal microscope,LSCM)動(dòng)態(tài)觀察TGFβ1 對(duì)牙 髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，為進(jìn)一步探明TGFβ1對(duì)牙髓細(xì)胞調(diào)節(jié)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提 供依據(jù)，為研究牙髓細(xì)胞分化及牙本質(zhì)形成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
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1 材料和方法
1.1 試劑
D-Hank液(g/L):NaCl 8.00， KCl 0.40, Na2HPO·4.12H2O 0.12, KH2PO4 0.06 , D-Glucose 1.00,NaHCO3 0.35,采用國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭┖统兯?18.2 MΩcm)配制。Fluo -3/AM系美國(guó)BIO-RAD產(chǎn)品；胰蛋白酶由華美生物工程公司購(gòu)得；小 牛 血清由杭州四季青生物工程材料研究所提供；DMEM培養(yǎng)基由美國(guó)GIBCO公司提供，TGF-β 1系美國(guó)PROMEGA公司產(chǎn)品。
1.2 牙髓細(xì)胞培養(yǎng)
選13～20歲因正畸或阻生拔除的完整新鮮恒牙(第一前磨牙及第三磨牙)，劈冠取出牙髓組 織，剪成1 mm3碎塊，鋪于培養(yǎng)瓶底，以含體積分?jǐn)?shù)(φ)為10%胎牛血清(FBS)的DMEM培 養(yǎng)液，φ(CO2為5%，φ(空氣)=95%，飽和濕度，37 ℃孵育做原代培養(yǎng)，取生長(zhǎng)良好的第 4代牙髓細(xì)胞接種在特制培養(yǎng)皿中 ，接種濃度2.5×108/L，細(xì)胞貼壁后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
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1.3 實(shí)驗(yàn)分組(每組復(fù)種兩個(gè)培養(yǎng)皿)
對(duì)照組：φ(FBS)=10%的DMEM
實(shí)驗(yàn)組：用φ(FBS)=10%的DMEM配制的質(zhì)量濃度為0.1 ng/L的TGF-β1溶液
1.4 牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+測(cè)定
1.4.1 測(cè)定原理 Fluo-3能特異性地與鈣離子結(jié)合，并在一定 波長(zhǎng)激發(fā)光激發(fā)后產(chǎn)生熒光，且與鈣離子結(jié)合后其熒光光譜發(fā)生變化，其熒光強(qiáng)度與Ca 2+濃 度成正比，因而可用于觀察Ca2+動(dòng)態(tài)變化〔4〕。但Fluo-3為極性大的酸性化 合物，難以進(jìn)入 細(xì)胞，而當(dāng)其結(jié)合上親酯的乙酰羥甲基酯成為脂溶性的Fluo-3/AM，再與細(xì)胞孵育時(shí)，便很 容易透過細(xì)胞膜，胞漿內(nèi)的非特異性酯酶將其脂解脫去脂基生成游離的Fluo-3。
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1.4.2 D-Hank液(pH7.4)洗滌標(biāo)本2次后，于37 ℃避光條件下用D-Hank液稀釋的Fluo -3/AM(10 μmol/L)荷載，40 min后再用D-Hank液洗滌細(xì)胞3次，最后保留少許細(xì)胞外 D-Hank液平衡10 min〔5〕，LSCM下觀察。
1.4.3 激光共聚焦圖像 LSCM能對(duì)活細(xì)胞內(nèi)部的離子分 布及隨時(shí)間的變化進(jìn)行成像及測(cè)量。本實(shí)驗(yàn)使用的是BIO-RAD公司的MRC-1024 LSCM。在 觀察C a2+快速變化時(shí)，可選線掃方式，其采樣頻率為488 Hz，與Ca2+結(jié)合的Fluo-3 可以被488 nm的 氬離子激光激發(fā)，可在525 nm處探測(cè)到熒光發(fā)射，其熒光強(qiáng)度的變化可指示胞內(nèi)游離鈣濃度 的相對(duì)變化。
1.4.4 加藥 在LSCM下選好細(xì)胞后，用微量加藥器將實(shí)驗(yàn)條件要求的試劑滴加在培養(yǎng)皿 中，試劑擴(kuò)散后進(jìn)行觀察
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1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理
數(shù)據(jù)均用
±s 表示，數(shù)據(jù)分析軟件為SPSS軟件。2 結(jié) 果
2.1 加藥前實(shí)驗(yàn)組(n=8)與對(duì)照組(n=6)牙髓細(xì)胞〔Ca2+〕i水平無明顯 差異：Ca2+含量少、熒 光強(qiáng)度弱，分布較均勻(圖1)。加藥后實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度隨時(shí)間明顯變化而對(duì)照組無明顯變 化(圖2,3)。
圖1 實(shí)驗(yàn)組加藥前牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣含量(LSCM，×400)
2.2 實(shí)驗(yàn)組牙髓細(xì)胞加入TGFβ(0.1 ng/L)后10 s，胞內(nèi)Ca2+開始上升，經(jīng)18 s后達(dá) 最高峰，此時(shí)熒光最強(qiáng)且分布不均，其中核周熒光最強(qiáng)(圖4)持續(xù)50 s后開始下降，經(jīng)45 s后鈣離子濃度趨于平穩(wěn)，但其水平仍稍高于加藥前靜息鈣水平(圖5)。其中，實(shí)驗(yàn)組熒光 強(qiáng)度最大(4.6±0.02)時(shí)所代表的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平與對(duì)照組(1.5±0.01)具有顯著差異 (P<0.01)，且實(shí)驗(yàn)組加藥后靜息熒光強(qiáng)度(2.8±0.01)所代表的胞內(nèi)Ca2+水平 與對(duì)照組(1.5±0.01)Ca2+水平也差別顯著(P<0.01)。
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圖2 TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣的影響(
為加藥處)圖中下線為基線，上兩條線是兩個(gè)不同細(xì)胞的熒光強(qiáng)度變化線
圖3 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組牙髓細(xì)胞內(nèi)鈣隨時(shí)間變化曲線(
為加藥處)3 討 論
鈣離子既是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的信使，又是骨、牙齒等硬組織的基本成分，其沉積引發(fā)的礦化是在嚴(yán)格的細(xì)胞控制下 完成的。研究表明，體外培養(yǎng)牙髓 細(xì)胞具有潛在的分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及發(fā)生礦化的能力〔6〕，而牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2 +水平能夠反應(yīng)出細(xì)胞的狀態(tài)、藥物、胞外環(huán)境對(duì)細(xì)胞的 影響〔7〕。因此，研究體 外培養(yǎng)牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化對(duì)研究牙髓細(xì)胞分化的誘導(dǎo)及礦化具有重要意義。
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圖4 牙髓細(xì)胞加入TGF-β1 28 s后細(xì)胞內(nèi)鈣英光顯示圖(LSCM，×400)
圖5 牙髓細(xì)胞加入TGFβ1 2min后〔Ca2+〕i水平
(LSCM，×400)
3.1 關(guān)于本研究的測(cè)量技術(shù)
目前測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的方法有：①鈣離子選擇微電極法，但該方法對(duì)于較小細(xì)胞內(nèi) 的操作較難且微電極反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)；②放射示蹤法，該方法可定性定量分析細(xì)胞內(nèi)外Ca 2+變化，主要 用于測(cè)定跨膜Ca2+流動(dòng)及代謝動(dòng)力學(xué)變化，但對(duì)細(xì)胞靜息Ca2+濃度測(cè)定操作復(fù) 雜且效果不理想；③熒光標(biāo)記示蹤法，由于細(xì)胞內(nèi)鈣熒光指示劑的發(fā)現(xiàn)和其性能的不斷完善 ， 該方法日見其優(yōu)越性。Fluo-3作為第3代熒光指示劑，是唯一在可見光區(qū)有激發(fā)峰的熒光 劑 ，可以避免紫外光對(duì)細(xì)胞的損害和激發(fā)自發(fā)熒光傾向，它與Ca2+結(jié)合后熒光強(qiáng)度增加 40倍，因此在觀察Ca2+的空間分布和快速時(shí)間變化方面，F(xiàn)luo-3的性能是目前最好 的 ，加之有激光共聚焦掃描技術(shù)配合，使細(xì)胞內(nèi)甚至細(xì)胞器內(nèi)Ca2+的空間和時(shí)間變化的 測(cè)定更加完善。
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3.2 TGF-β1對(duì)牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響
通常情況下，由于細(xì)胞內(nèi)存在豐富的鈣平衡系統(tǒng)，故可維持比細(xì)胞外低5000～10000倍的Ca 2+ 濃度〔9〕，但當(dāng)細(xì)胞受到不同外界刺激時(shí)其細(xì)胞內(nèi)鈣會(huì)發(fā)生一定的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié) 果顯示， TGF-β1可使牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+先升高后降低。一般來說，細(xì)胞內(nèi)鈣升高機(jī) 制 有以下三種：①通過IP3引起細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體中Ca2+釋放入細(xì)胞漿；②神經(jīng)沖 動(dòng)使 電壓依賴性鈣通道開放，Ca2+內(nèi)流；③通過cAMP激活A(yù)PK使鈣通道磷酸化而變構(gòu)開放〔8〕。而TGF-β的3種受體都含有絲氨酸-蘇氨酸序列，并且TGF-βRI和TGF-βRII 具有內(nèi)在絲氨酸-蘇氨酸激酶活性〔9〕。 因此，TGF-β作用的可能機(jī)制是TGF-β與其受體結(jié)合后，受體被激活，從而活化PLC，后 者可 催化PIP2分解為DG和IP3，IP3作為第二信使作用于細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)上的IP3受體，釋放C a2+入細(xì) 胞漿。同時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+枯竭后能激活細(xì)胞膜上的鈣通道引發(fā)Ca2+持續(xù)內(nèi)流而 使〔Ca2+〕i升高。
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通常一過性的細(xì)胞內(nèi)鈣升高可以傳遞信息，并可引發(fā)一系列有重要生理意義的生物學(xué) 效應(yīng)，而慢性持續(xù)性的細(xì)胞內(nèi)鈣升高則會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生鈣毒性。因此，為了保持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài) ，細(xì)胞會(huì)動(dòng)用豐富的鈣平衡系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣水平。調(diào)節(jié)Ca2+平衡的相關(guān)蛋白有鈣泵 (Ca2+ ATP酶)、Ca2+通道蛋白、Na+/Ca2+交換蛋白、Ca2+轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白及眾多 的鈣結(jié)合蛋白。TGF-β可使牙髓細(xì)胞ALP活性升高〔9〕，促進(jìn) ALP水 解ATP為運(yùn)輸Ca2+、PO42-提供能量， 因胞內(nèi)鈣濃度升高而活化的Ca2+泵利用ATP水解產(chǎn)生的能量、Na+/Ca2+交換 蛋白活 化利用Na+順濃度梯度入胞的能量將Ca2+逆濃度差泵出細(xì)胞外，從而使〔C a2+〕i降低。
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本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1使細(xì)胞內(nèi)Ca2+波動(dòng)后維持在比 加藥前稍高 的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平上(P<0.01)，提示TGF-β作用于牙髓細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)C a2+經(jīng)各種信號(hào)分 子調(diào)節(jié)而波動(dòng)后，細(xì)胞可重新建立新的鈣平衡，即在無細(xì)胞鈣毒性前提下提高了細(xì)胞內(nèi)靜息 鈣水平，而這種變化對(duì)于牙髓細(xì)胞分化具有重要意義。此外，本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，Ca2+ 變化有空間特異性，靜息狀態(tài)下胞質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度高于核內(nèi)，TGF-β1作用后細(xì)胞核周Ca 2+升高 幅度較大，在核周形成明顯的不延續(xù)的周暈，這可能是由于核區(qū)存在某些鈣結(jié)合物，或者有 Ca2+轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞核內(nèi)。詳細(xì)機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。
4 結(jié) 論
TGFβ能引起牙髓細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的顯著變化， TGF-β使胞漿及胞核 內(nèi)的〔Ca2+〕i均經(jīng)歷先升高后降低的變化，并維持在比加藥前稍高的靜息Ca2 +水平上。證明Ca 2+參與了TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程并參與將信號(hào)轉(zhuǎn)入核內(nèi)�！�
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本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 批準(zhǔn)號(hào) 39870789
參考文獻(xiàn)
[1]Nakashima M. The effects of growth factors on DNA synthesis,proteoglycan synthesis and alkaline phosphatase activity in bovine dental pulp cell. Arch Or al Biol,1992,37:231
[2]Shirakawa M, Shiba H, Nakanishi K, et al. Transforming growth factor-β1 r educe alkaline phosphatase mRNA and activity and stimulates cell proliferation i n cultures of human pulp cells. J Dent Res,1994,73:1509
, http://www.www.srpcoatings.com
[3]Toyono T, Nakashima M, Kuhara S.et al Temporal changes in expression of tr ansforming growth factor-beta superfamily members and their receptors during b ovine preo dontoblast differentiation in vitro. Arch Oral Biol,1997,42(7): 481
[4]Tsien RY. Fluorecence measurement and photochemical manipulation of cytosoli c calcium. TINS,1988,11(10):419
[5]Satoh H, Blatter LA, Bers DM. Effects of 〔Ca2+〕i SR Ca2+ load ,a nd rest on Ca2+ spark frequency in ventricular myocytes. Am J Physiol,1997 ,272(Heart Circ Physiol 41):H657
, http://www.www.srpcoatings.com
[6]Tsukamoto Y,Fukutani S,Shin-ike T,et al. Mineralized nodule formation by c ultures of human dental pulp-derived fibroblast. Arch Oral Biol,1992,37(12):104 5
[7]Mary BK. Regulation of neuronal function by calcium. TINS,1989,12(11):417
[8]顧天爵主編. 生物化學(xué).第4版. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1996.321
[9]Takemi T, Moustakas A, Lin HY, et al. Molecular characterization of a type I serine-theronine kinase receptor for TGFβand activin in the rat pituitary tum or cell line GH3. Exp Cell Res,1995,216:208
收稿日期：2000-01-31
修稿日期：2000-02-28, 百拇醫(yī)藥