生物芯片技術(shù)與縮微實(shí)驗(yàn)室
作者：許俊泉 萬(wàn)妮 程京
單位：許俊泉(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)；萬(wàn)妮(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)；程京(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)
關(guān)鍵詞：
醫(yī)學(xué)與哲學(xué)000203摘要：基于微加工技術(shù)發(fā)展起來(lái)的生物芯片，可以把成千上萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)個(gè)生命信息集成在一個(gè)很小的芯片上，對(duì)基因、抗原和活體細(xì)胞等進(jìn)行分析和檢測(cè)。用這些生物芯片制作的各種生化分析儀和傳統(tǒng)儀器相比較具有體積小、重量輕、便于攜帶、無(wú)污染、分析過(guò)程自動(dòng)化、分析速度快、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)。這類(lèi)儀器的出現(xiàn)將給生命科學(xué)研究、疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭(zhēng)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、航空航天等領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命。
中圖分類(lèi)號(hào)：R318 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A
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文章編號(hào)：1002-0772(2000)02-0008-03
Biochip Technology and lab-on-a-chip
XU Jun-quan WAN Ni CHENG Jing
(Biochip Research & Development Center,Tsinghua University,Beijing 100084,China)
Abstract：Biochip as a new research field has enjoyed its rapid development in the past 10 years.Using microfabrication technology,thousands or hundred thousands of biological molecules can be assembled on a microchip.Those chip-based devices can be used to analyze mutations,antigens,cells,etc.Compared to the traditional analytical instruments,chip-based micro total analytical systems have many advantages,such as reduced size,lower consumption of both reagents and energy,contamination-free,etc.Biochip technology is believed to revolutionize the future research in life sciences,disease diagnosis,drug discovery,forensic sciences and outer space exploitation.
, 百拇醫(yī)藥
Key Words：biochip;lab-on-a-chip;disease diagnosis
1 生物芯片的微加工制備
生物芯片的加工所依賴(lài)的是微電子工業(yè)中應(yīng)用十分成熟的一些微細(xì)加工工藝。但目前用的最多的仍還是超大規(guī)模集成電路生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的一種被稱(chēng)之為光學(xué)光刻的技術(shù)，采用這種技術(shù)對(duì)硅片進(jìn)行加工的過(guò)程與擴(kuò)印像片的原理是相似的。所不同的只是硅片取代了印象紙，具有微細(xì)結(jié)構(gòu)的掩模板取代了底片。光學(xué)光刻的第一步是通過(guò)光學(xué)制板照相制備掩模，制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板，該鉻層事先已按微細(xì)結(jié)構(gòu)的圖形被刻蝕成了透光和不透光兩個(gè)部分。第二步是光刻，該過(guò)程中，讓掩模與表面涂有光刻膠的硅片接觸，然后讓光源通過(guò)掩摸照射到硅片上，通過(guò)顯影光刻膠中的圖形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通過(guò)對(duì)無(wú)膠保護(hù)的硅片用腐蝕劑蝕劑，再去除剩余的光刻膠便可獲得所需生物芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)。這種方法主要用于加工下述用于生物樣品處理、化學(xué)反應(yīng)以及毛細(xì)管電泳的芯片。在DNA芯片的制作過(guò)程中，比較典型的方法有四種：一個(gè)是Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法。這種方法是上述光學(xué)光刻法與光化學(xué)合成法結(jié)合的結(jié)晶。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司所采用的化學(xué)噴射法。該方法是將合成好的寡核苷酸探針定點(diǎn)噴射到芯片上來(lái)制作DNA芯片的。第三種是Synteni公司所使用的接觸式點(diǎn)涂法，它在DNA芯片制備中使用的是高速精密機(jī)械手通過(guò)讓移液頭與玻璃芯片接觸而將探針定位點(diǎn)滴到芯片上的。第四種方法是通過(guò)使用四支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴頭在芯片上并行合成出DNA探針的。
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2 生物芯片三個(gè)組成部分的功用
DNA分析的生物芯片大致由三個(gè)部分組成。這三個(gè)部分的功能分別是核酸樣品的制備、DNA片段的化學(xué)反應(yīng)制備、DNA片段的毛細(xì)管電泳檢測(cè)或雜交分析。
以下論述這三個(gè)方面的基本工作原理和研究現(xiàn)狀。
2.1 核酸樣品的制備細(xì)胞的過(guò)濾分離
針對(duì)人白細(xì)胞的分離，賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組研究出了一種芯片微過(guò)濾法。采用這種方法，首先就必須制作出微過(guò)濾用的芯片。加工芯片過(guò)濾器是通過(guò)在硅片上刻出各種形狀的過(guò)濾通道大小為幾個(gè)微米的幾何結(jié)構(gòu)，然后，再在硅芯片上燒結(jié)上一塊玻璃蓋片而完成。芯片微過(guò)濾法的工作原理是根據(jù)人白細(xì)胞的尺寸比紅細(xì)胞大的特點(diǎn)，使人外周血流過(guò)微過(guò)濾器時(shí)只讓血漿和尺寸較小的紅血細(xì)胞及血小板通過(guò)，而截住尺寸較大的白細(xì)胞。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)和設(shè)計(jì)，微芯片過(guò)濾器已從最初的豎式Z形結(jié)構(gòu)，通過(guò)過(guò)渡改型成為豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)，到最后定型為橫壩式結(jié)構(gòu)。采用橫壩式結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是人白細(xì)胞的回收率高，過(guò)濾器不容易被堵塞。橫壩式過(guò)濾通道的尺寸為3.5微米。微芯片過(guò)濾器的另一應(yīng)用是它可將孕婦外周血中的極少量的胎兒細(xì)胞過(guò)濾出來(lái)，供下一步作產(chǎn)前診斷之用。
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細(xì)胞的介電電泳分離和電子胞解
為了把不同的癌細(xì)胞、細(xì)菌或病毒從血樣、水樣或其他液體樣品中分離出來(lái)，人們?cè)O(shè)計(jì)加工出了用作介電電泳的生物電子芯片。通過(guò)在硅芯片上制作一系列各種排列的金屬電極和在這些電極上施加高頻電場(chǎng)，就可在不同的細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極，而這些偶電極的出現(xiàn)又反過(guò)來(lái)使得不同的細(xì)胞要么承受正介電力，要么承受負(fù)介電力，而能夠讓它們從各種液體樣品中分離出來(lái)。
2.2 芯片中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)
目前，在芯片中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得成功的有賓夕法尼亞大學(xué)研究小組，美國(guó)勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和PE公司。賓夕法尼亞大學(xué)研究小組所做的擴(kuò)增反應(yīng)都是在12微升的硅—玻璃芯片中進(jìn)行的，芯片的外部加熱和冷卻采用的是計(jì)算機(jī)控制的帕爾貼電熱器。在對(duì)芯片表面進(jìn)行惰性處理后，亦即在硅片表面生長(zhǎng)一層2 000埃的氧化硅之后，他們成功地在硅—玻璃芯片中完成一系列不同的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室所加工的硅芯片體積為20～40微升，他們所采用的加熱方式是芯片內(nèi)置的薄膜多晶硅加熱套，所完成的擴(kuò)增反應(yīng)是多重PCR。PE公司的PCR反應(yīng)則是在單個(gè)反應(yīng)器體積小至0.5微升的塑料芯片上完成的。上述所有工作都是用事先提純了的DNA或RNA作為擴(kuò)增反應(yīng)的底物來(lái)完成的。為了將樣品制備和擴(kuò)增反應(yīng)集成為一體，賓夕法尼亞大學(xué)研究小組最近成功地在壩式微過(guò)濾芯片中直接對(duì)分離所得的人白細(xì)胞胞解后的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了與人肌萎縮基因中的外顯子6個(gè)對(duì)應(yīng)的大小為202bp的DNA片段，該產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析獲得了確認(rèn)，這是世界上首例將樣品制備和擴(kuò)增反應(yīng)集成為一體的研究成果。
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2.3 DNA的芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)和雜交分析突變檢測(cè)
芯片毛細(xì)管電泳是1983年由杜邦公司的Pace開(kāi)發(fā)出來(lái)的。隨后，瑞士的Ciba-Geigy公司和加拿大的Alberta大學(xué)合作利用玻璃芯片毛細(xì)管電泳完成對(duì)寡核苷酸的分離。首次用芯片毛細(xì)管陣列電泳檢測(cè)DNA突變的工作是由加利福尼亞大學(xué)伯格利分校Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成的。通過(guò)在芯片上加上很高的直流電壓，他們?cè)诮鼉煞昼姷臅r(shí)間內(nèi)完成了從118bp到1 353bp的許多DNA片段的快速分離。此外，Mathies的小組與勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Nothrup的研究小組合作，報(bào)道了首例將核酸擴(kuò)增反應(yīng)與芯片毛細(xì)管電泳集成為一體所作的多重PCR檢測(cè)工作。另外，美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Ramsey研究小組成功地在玻璃芯片中對(duì)DNA先作限制性?xún)?nèi)切酶酶切，然后再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。賓夕法尼亞大學(xué)Wilding的小組與Ramsey的小組一道用芯片毛細(xì)管電泳對(duì)芯片中擴(kuò)增得到的用于杜鑫—貝克肌萎縮診斷的多條DNA片段進(jìn)行分離也獲得了成功。其他用芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)突變的外國(guó)公司的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)有PE公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司、麻省理工等。
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DNA之所以能進(jìn)行雜交是因?yàn)楹塑誂和T、G和C可同時(shí)以氫鍵結(jié)合互補(bǔ)成對(duì)。許多經(jīng)典的分子生物學(xué)方法如桑格DNA測(cè)序法和PCR等都是以此為基礎(chǔ)的。最近出現(xiàn)的幾項(xiàng)技術(shù)，如用光刻掩膜技術(shù)合成DNA、電子雜交技術(shù)、高靈敏度自動(dòng)共焦熒光顯微鏡掃描技術(shù)等，使以雜交為基礎(chǔ)的應(yīng)用有了長(zhǎng)足的改善。最近的一些英文權(quán)威刊物對(duì)應(yīng)用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)突變作了報(bào)道。Hacia等人采用由96000個(gè)寡核苷酸探針?biāo)M成的雜交芯片，完成了對(duì)遺傳性乳腺癌和卵巢腫瘤基因BRCA1中外顯子上的24個(gè)異合突變(單核苷突變多態(tài)性)的檢測(cè)。他們通過(guò)引入?yún)⒄招盘?hào)和被檢測(cè)信號(hào)之間的色差分析使得雜交的特異性和檢測(cè)靈敏度獲得了提高。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探針芯片對(duì)HIV病株的多態(tài)性作了分析。Cronin等人用固化有428個(gè)探針的芯片對(duì)導(dǎo)致肺部囊性纖維化的突變基因進(jìn)行了檢測(cè)。用生物芯片從事檢測(cè)突變的美國(guó)公司有貝克曼儀器公司、惠普公司、Abbot Laboratory公司、Affymetrix、Nanogen、David Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hyseq、Molecular、Tool、Molecular Dynamics等；英美學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)有賓夕法尼亞大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院、牛津大學(xué)、Whitehead Institute for Biomedical Research,Houston Advanced Research Center,Naval Research Laboratory,Argonne National Laboratory。
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DNA測(cè)序
芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序的原理與普通毛細(xì)管電泳測(cè)序的原理相同。目前世界上唯一報(bào)道芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果的是Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組。他們利用芯片變性毛細(xì)管電泳在10分鐘之內(nèi)就完成了對(duì)433個(gè)堿基序列的測(cè)定。該測(cè)序芯片中通過(guò)光刻加工出的毛細(xì)管長(zhǎng)度為3.5cm，橫切面尺寸50μm×8μm。此外，從事芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序的其他美國(guó)公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)為CuraGen公司和普林斯頓大學(xué)。
用芯片分析DNA的另一應(yīng)用技術(shù)是雜交測(cè)序。多么，雜交測(cè)序是怎么工作的呢?首先，人們將長(zhǎng)度為8～20個(gè)核苷的探針合成出來(lái)，然后將它們按照象圍棋盤(pán)那樣的布置固定化到指甲蓋大小的硅芯片或玻璃芯片上。當(dāng)含有與探針序列互補(bǔ)的DNA與其他無(wú)關(guān)DNA的混合物被置于聯(lián)有探針的芯片上之后，固化探針就會(huì)通過(guò)與其序列互補(bǔ)的DNA片段雜交而將其從很復(fù)雜的混合樣品分離出來(lái)。通過(guò)使用帶有計(jì)算機(jī)的熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)“棋盤(pán)”每個(gè)格子上的熒光強(qiáng)弱及根據(jù)每個(gè)格子上已知探針的序列進(jìn)行分析與組合就可得知樣品DNA所含有的堿基序列。最近的美國(guó)Science雜志對(duì)應(yīng)用芯片雜交技術(shù)測(cè)序作了報(bào)道。Chee等人在一塊固化有135 000個(gè)寡核苷酸探針(每個(gè)探針長(zhǎng)度為25個(gè)核苷)的硅芯片上對(duì)長(zhǎng)度為166kbp的整個(gè)人線(xiàn)粒體基因組作了序列測(cè)定。每個(gè)探針之間的空間間隔為35μm，測(cè)序精度為99°。此外，通過(guò)對(duì)11個(gè)非洲人個(gè)體樣品進(jìn)行分析，他們發(fā)現(xiàn)在這些樣品的線(xiàn)粒體DNA中所存在的突變多態(tài)性多達(dá)505個(gè)。用生物芯片從事雜交測(cè)序的美國(guó)公司有Affymetrix和Hsysen.
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基因表達(dá)分析
隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，越來(lái)越多的能夠表達(dá)的人基因序列以及引發(fā)疾病和能預(yù)測(cè)疾病的各種突變正在為人們逐漸認(rèn)識(shí)。為了能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)可能的遺傳突變進(jìn)行搜尋，加快功能基因組學(xué)研究的進(jìn)程，人們現(xiàn)已把越來(lái)越多的注意力放到了能同時(shí)提供有關(guān)多個(gè)基因及其序列的所謂并行分子遺傳學(xué)分析方法上。功能基因組學(xué)所研究的是在特定組織中，發(fā)育的不同階段或者是疾病的不同時(shí)期基因的表達(dá)情況。因此它的要求是要能在同一時(shí)刻獲得多個(gè)分子遺傳學(xué)分析的結(jié)果。譬如，許多疾病引發(fā)基因可能會(huì)有數(shù)以百計(jì)的與表征有關(guān)的特定突變。因而，要求能有同時(shí)篩檢這些突變的有效方法。另外，任何一個(gè)細(xì)胞中都會(huì)有上千個(gè)基因在表達(dá)。而細(xì)胞間基因表達(dá)的差異往往能反映出這些細(xì)胞是發(fā)育正常還是在朝惡性腫瘤細(xì)胞方向發(fā)展。采用芯片利用雜交對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的好處是它能用很少的細(xì)胞物質(zhì)便能提供有關(guān)多基因差異表達(dá)的信息，從而給疾病診斷和藥物篩選帶來(lái)了巨大沖擊。Lockhart等人采用基其上固化有由65 000個(gè)不同序列的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷的探針芯片，定量地分析了一個(gè)小鼠T細(xì)胞線(xiàn)中整個(gè)RNA群體中21個(gè)各不相同的信使RNA。這些專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的探針能與114個(gè)已知的小鼠基因雜交。分析發(fā)現(xiàn)在誘發(fā)生成細(xì)胞分裂后，另有20個(gè)信使RNA的表達(dá)也發(fā)生了改變。檢測(cè)結(jié)果表明該系統(tǒng)對(duì)RNA的檢出率為1∶300 000，對(duì)信使RNA的定量基準(zhǔn)為1∶300。DeRisi等人將一個(gè)惡性腫瘤細(xì)胞線(xiàn)中得到的870個(gè)不同的cDNA探針通過(guò)機(jī)械手“刷印”到載玻片上以觀(guān)察癌基因的表達(dá)情況，在比較兩個(gè)標(biāo)有不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞信使RNA群的雜交結(jié)果之后，他們對(duì)引入正常人染色體后腫瘤基因受到抑制的細(xì)胞中的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了分析。另外，Shoemaker等人報(bào)道了一種利用生物芯片來(lái)確定許多新近發(fā)現(xiàn)的酵母基因的生物功能的所謂分子條形編碼技術(shù)。這種技術(shù)的好處是它能讓我們以并行的方式定量地分析很復(fù)雜的核酸混合物。
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3 結(jié)尾
以生物芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的另外一個(gè)很有應(yīng)用價(jià)值的研究方向是用生物芯片技術(shù)所具有的高集成度與組合化學(xué)相結(jié)合，為新藥研究的初篩提供超高通量篩選(Ultra-High Throughput Screening)。另外，用生物芯片技術(shù)還可以對(duì)中藥的真?zhèn)魏陀行С煞诌M(jìn)行快速鑒定和分析。在材料上，除了用硅作生物芯片的加工之外，有的研究單位現(xiàn)已開(kāi)始采用塑料成模工藝和彈性體來(lái)加工制作生物芯片。采用塑料或彈性體的好處是生產(chǎn)成本可進(jìn)一步降低，用過(guò)的芯片更便于丟棄處置，樣品和試劑所面臨的表面化學(xué)問(wèn)題更容易得到解決。
作者簡(jiǎn)介：許俊泉(1975～)，男，福建莆田人，碩士。清華大學(xué)生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心。
收稿日期：1999-12-06, 百拇醫(yī)藥
單位：許俊泉(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)；萬(wàn)妮(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)；程京(清華大學(xué) 生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心，北京 100084)
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醫(yī)學(xué)與哲學(xué)000203摘要：基于微加工技術(shù)發(fā)展起來(lái)的生物芯片，可以把成千上萬(wàn)乃至幾十萬(wàn)個(gè)生命信息集成在一個(gè)很小的芯片上，對(duì)基因、抗原和活體細(xì)胞等進(jìn)行分析和檢測(cè)。用這些生物芯片制作的各種生化分析儀和傳統(tǒng)儀器相比較具有體積小、重量輕、便于攜帶、無(wú)污染、分析過(guò)程自動(dòng)化、分析速度快、所需樣品和試劑少等諸多優(yōu)點(diǎn)。這類(lèi)儀器的出現(xiàn)將給生命科學(xué)研究、疾病診斷和治療、新藥開(kāi)發(fā)、生物武器戰(zhàn)爭(zhēng)、司法鑒定、食品衛(wèi)生監(jiān)督、航空航天等領(lǐng)域帶來(lái)一場(chǎng)革命。
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Abstract：Biochip as a new research field has enjoyed its rapid development in the past 10 years.Using microfabrication technology,thousands or hundred thousands of biological molecules can be assembled on a microchip.Those chip-based devices can be used to analyze mutations,antigens,cells,etc.Compared to the traditional analytical instruments,chip-based micro total analytical systems have many advantages,such as reduced size,lower consumption of both reagents and energy,contamination-free,etc.Biochip technology is believed to revolutionize the future research in life sciences,disease diagnosis,drug discovery,forensic sciences and outer space exploitation.
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1 生物芯片的微加工制備
生物芯片的加工所依賴(lài)的是微電子工業(yè)中應(yīng)用十分成熟的一些微細(xì)加工工藝。但目前用的最多的仍還是超大規(guī)模集成電路生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的一種被稱(chēng)之為光學(xué)光刻的技術(shù)，采用這種技術(shù)對(duì)硅片進(jìn)行加工的過(guò)程與擴(kuò)印像片的原理是相似的。所不同的只是硅片取代了印象紙，具有微細(xì)結(jié)構(gòu)的掩模板取代了底片。光學(xué)光刻的第一步是通過(guò)光學(xué)制板照相制備掩模，制備好的掩模通常是鍍有鉻層的石英玻璃板，該鉻層事先已按微細(xì)結(jié)構(gòu)的圖形被刻蝕成了透光和不透光兩個(gè)部分。第二步是光刻，該過(guò)程中，讓掩模與表面涂有光刻膠的硅片接觸，然后讓光源通過(guò)掩摸照射到硅片上，通過(guò)顯影光刻膠中的圖形，使其上未被掩模遮掩的部分被溶解除去。上述工作完成之后，通過(guò)對(duì)無(wú)膠保護(hù)的硅片用腐蝕劑蝕劑，再去除剩余的光刻膠便可獲得所需生物芯片的微細(xì)結(jié)構(gòu)。這種方法主要用于加工下述用于生物樣品處理、化學(xué)反應(yīng)以及毛細(xì)管電泳的芯片。在DNA芯片的制作過(guò)程中，比較典型的方法有四種：一個(gè)是Affymetrix公司開(kāi)發(fā)的光引導(dǎo)原位合成法。這種方法是上述光學(xué)光刻法與光化學(xué)合成法結(jié)合的結(jié)晶。第二種方法是Incyte Pharmaceutical公司所采用的化學(xué)噴射法。該方法是將合成好的寡核苷酸探針定點(diǎn)噴射到芯片上來(lái)制作DNA芯片的。第三種是Synteni公司所使用的接觸式點(diǎn)涂法，它在DNA芯片制備中使用的是高速精密機(jī)械手通過(guò)讓移液頭與玻璃芯片接觸而將探針定位點(diǎn)滴到芯片上的。第四種方法是通過(guò)使用四支分別裝有A、T、G、C核苷的壓電噴頭在芯片上并行合成出DNA探針的。
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2 生物芯片三個(gè)組成部分的功用
DNA分析的生物芯片大致由三個(gè)部分組成。這三個(gè)部分的功能分別是核酸樣品的制備、DNA片段的化學(xué)反應(yīng)制備、DNA片段的毛細(xì)管電泳檢測(cè)或雜交分析。
以下論述這三個(gè)方面的基本工作原理和研究現(xiàn)狀。
2.1 核酸樣品的制備細(xì)胞的過(guò)濾分離
針對(duì)人白細(xì)胞的分離，賓夕法尼亞大學(xué)的研究小組研究出了一種芯片微過(guò)濾法。采用這種方法，首先就必須制作出微過(guò)濾用的芯片。加工芯片過(guò)濾器是通過(guò)在硅片上刻出各種形狀的過(guò)濾通道大小為幾個(gè)微米的幾何結(jié)構(gòu)，然后，再在硅芯片上燒結(jié)上一塊玻璃蓋片而完成。芯片微過(guò)濾法的工作原理是根據(jù)人白細(xì)胞的尺寸比紅細(xì)胞大的特點(diǎn)，使人外周血流過(guò)微過(guò)濾器時(shí)只讓血漿和尺寸較小的紅血細(xì)胞及血小板通過(guò)，而截住尺寸較大的白細(xì)胞。通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)和設(shè)計(jì)，微芯片過(guò)濾器已從最初的豎式Z形結(jié)構(gòu)，通過(guò)過(guò)渡改型成為豎式條狀梳式結(jié)構(gòu)，到最后定型為橫壩式結(jié)構(gòu)。采用橫壩式結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)是人白細(xì)胞的回收率高，過(guò)濾器不容易被堵塞。橫壩式過(guò)濾通道的尺寸為3.5微米。微芯片過(guò)濾器的另一應(yīng)用是它可將孕婦外周血中的極少量的胎兒細(xì)胞過(guò)濾出來(lái)，供下一步作產(chǎn)前診斷之用。
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細(xì)胞的介電電泳分離和電子胞解
為了把不同的癌細(xì)胞、細(xì)菌或病毒從血樣、水樣或其他液體樣品中分離出來(lái)，人們?cè)O(shè)計(jì)加工出了用作介電電泳的生物電子芯片。通過(guò)在硅芯片上制作一系列各種排列的金屬電極和在這些電極上施加高頻電場(chǎng)，就可在不同的細(xì)胞內(nèi)感應(yīng)出偶電極，而這些偶電極的出現(xiàn)又反過(guò)來(lái)使得不同的細(xì)胞要么承受正介電力，要么承受負(fù)介電力，而能夠讓它們從各種液體樣品中分離出來(lái)。
2.2 芯片中的核酸擴(kuò)增反應(yīng)
目前，在芯片中進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)獲得成功的有賓夕法尼亞大學(xué)研究小組，美國(guó)勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室和PE公司。賓夕法尼亞大學(xué)研究小組所做的擴(kuò)增反應(yīng)都是在12微升的硅—玻璃芯片中進(jìn)行的，芯片的外部加熱和冷卻采用的是計(jì)算機(jī)控制的帕爾貼電熱器。在對(duì)芯片表面進(jìn)行惰性處理后，亦即在硅片表面生長(zhǎng)一層2 000埃的氧化硅之后，他們成功地在硅—玻璃芯片中完成一系列不同的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，例如RT-PCR、LCR、多重PCR和DOP-PCR。由勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室所加工的硅芯片體積為20～40微升，他們所采用的加熱方式是芯片內(nèi)置的薄膜多晶硅加熱套，所完成的擴(kuò)增反應(yīng)是多重PCR。PE公司的PCR反應(yīng)則是在單個(gè)反應(yīng)器體積小至0.5微升的塑料芯片上完成的。上述所有工作都是用事先提純了的DNA或RNA作為擴(kuò)增反應(yīng)的底物來(lái)完成的。為了將樣品制備和擴(kuò)增反應(yīng)集成為一體，賓夕法尼亞大學(xué)研究小組最近成功地在壩式微過(guò)濾芯片中直接對(duì)分離所得的人白細(xì)胞胞解后的DNA進(jìn)行了擴(kuò)增，得到了與人肌萎縮基因中的外顯子6個(gè)對(duì)應(yīng)的大小為202bp的DNA片段，該產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳分析獲得了確認(rèn)，這是世界上首例將樣品制備和擴(kuò)增反應(yīng)集成為一體的研究成果。
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2.3 DNA的芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)和雜交分析突變檢測(cè)
芯片毛細(xì)管電泳是1983年由杜邦公司的Pace開(kāi)發(fā)出來(lái)的。隨后，瑞士的Ciba-Geigy公司和加拿大的Alberta大學(xué)合作利用玻璃芯片毛細(xì)管電泳完成對(duì)寡核苷酸的分離。首次用芯片毛細(xì)管陣列電泳檢測(cè)DNA突變的工作是由加利福尼亞大學(xué)伯格利分校Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組完成的。通過(guò)在芯片上加上很高的直流電壓，他們?cè)诮鼉煞昼姷臅r(shí)間內(nèi)完成了從118bp到1 353bp的許多DNA片段的快速分離。此外，Mathies的小組與勞倫斯。利物國(guó)家實(shí)驗(yàn)室Nothrup的研究小組合作，報(bào)道了首例將核酸擴(kuò)增反應(yīng)與芯片毛細(xì)管電泳集成為一體所作的多重PCR檢測(cè)工作。另外，美國(guó)橡樹(shù)嶺國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的Ramsey研究小組成功地在玻璃芯片中對(duì)DNA先作限制性?xún)?nèi)切酶酶切，然后再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)。賓夕法尼亞大學(xué)Wilding的小組與Ramsey的小組一道用芯片毛細(xì)管電泳對(duì)芯片中擴(kuò)增得到的用于杜鑫—貝克肌萎縮診斷的多條DNA片段進(jìn)行分離也獲得了成功。其他用芯片毛細(xì)管電泳檢測(cè)突變的外國(guó)公司的學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)有PE公司、Caliper Technologies公司、Aclara Biosciences公司、麻省理工等。
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DNA之所以能進(jìn)行雜交是因?yàn)楹塑誂和T、G和C可同時(shí)以氫鍵結(jié)合互補(bǔ)成對(duì)。許多經(jīng)典的分子生物學(xué)方法如桑格DNA測(cè)序法和PCR等都是以此為基礎(chǔ)的。最近出現(xiàn)的幾項(xiàng)技術(shù)，如用光刻掩膜技術(shù)合成DNA、電子雜交技術(shù)、高靈敏度自動(dòng)共焦熒光顯微鏡掃描技術(shù)等，使以雜交為基礎(chǔ)的應(yīng)用有了長(zhǎng)足的改善。最近的一些英文權(quán)威刊物對(duì)應(yīng)用芯片雜交技術(shù)檢測(cè)突變作了報(bào)道。Hacia等人采用由96000個(gè)寡核苷酸探針?biāo)M成的雜交芯片，完成了對(duì)遺傳性乳腺癌和卵巢腫瘤基因BRCA1中外顯子上的24個(gè)異合突變(單核苷突變多態(tài)性)的檢測(cè)。他們通過(guò)引入?yún)⒄招盘?hào)和被檢測(cè)信號(hào)之間的色差分析使得雜交的特異性和檢測(cè)靈敏度獲得了提高。另外，Kozal等人用高密度HIV寡核苷酸探針芯片對(duì)HIV病株的多態(tài)性作了分析。Cronin等人用固化有428個(gè)探針的芯片對(duì)導(dǎo)致肺部囊性纖維化的突變基因進(jìn)行了檢測(cè)。用生物芯片從事檢測(cè)突變的美國(guó)公司有貝克曼儀器公司、惠普公司、Abbot Laboratory公司、Affymetrix、Nanogen、David Sarnoff、Genometrix、Vysis、Hyseq、Molecular、Tool、Molecular Dynamics等；英美學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)有賓夕法尼亞大學(xué)、貝勒醫(yī)學(xué)院、牛津大學(xué)、Whitehead Institute for Biomedical Research,Houston Advanced Research Center,Naval Research Laboratory,Argonne National Laboratory。
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DNA測(cè)序
芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序的原理與普通毛細(xì)管電泳測(cè)序的原理相同。目前世界上唯一報(bào)道芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序結(jié)果的是Mathies領(lǐng)導(dǎo)的研究小組。他們利用芯片變性毛細(xì)管電泳在10分鐘之內(nèi)就完成了對(duì)433個(gè)堿基序列的測(cè)定。該測(cè)序芯片中通過(guò)光刻加工出的毛細(xì)管長(zhǎng)度為3.5cm，橫切面尺寸50μm×8μm。此外，從事芯片毛細(xì)管電泳測(cè)序的其他美國(guó)公司和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)為CuraGen公司和普林斯頓大學(xué)。
用芯片分析DNA的另一應(yīng)用技術(shù)是雜交測(cè)序。多么，雜交測(cè)序是怎么工作的呢?首先，人們將長(zhǎng)度為8～20個(gè)核苷的探針合成出來(lái)，然后將它們按照象圍棋盤(pán)那樣的布置固定化到指甲蓋大小的硅芯片或玻璃芯片上。當(dāng)含有與探針序列互補(bǔ)的DNA與其他無(wú)關(guān)DNA的混合物被置于聯(lián)有探針的芯片上之后，固化探針就會(huì)通過(guò)與其序列互補(bǔ)的DNA片段雜交而將其從很復(fù)雜的混合樣品分離出來(lái)。通過(guò)使用帶有計(jì)算機(jī)的熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)“棋盤(pán)”每個(gè)格子上的熒光強(qiáng)弱及根據(jù)每個(gè)格子上已知探針的序列進(jìn)行分析與組合就可得知樣品DNA所含有的堿基序列。最近的美國(guó)Science雜志對(duì)應(yīng)用芯片雜交技術(shù)測(cè)序作了報(bào)道。Chee等人在一塊固化有135 000個(gè)寡核苷酸探針(每個(gè)探針長(zhǎng)度為25個(gè)核苷)的硅芯片上對(duì)長(zhǎng)度為166kbp的整個(gè)人線(xiàn)粒體基因組作了序列測(cè)定。每個(gè)探針之間的空間間隔為35μm，測(cè)序精度為99°。此外，通過(guò)對(duì)11個(gè)非洲人個(gè)體樣品進(jìn)行分析，他們發(fā)現(xiàn)在這些樣品的線(xiàn)粒體DNA中所存在的突變多態(tài)性多達(dá)505個(gè)。用生物芯片從事雜交測(cè)序的美國(guó)公司有Affymetrix和Hsysen.
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基因表達(dá)分析
隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的順利進(jìn)行，越來(lái)越多的能夠表達(dá)的人基因序列以及引發(fā)疾病和能預(yù)測(cè)疾病的各種突變正在為人們逐漸認(rèn)識(shí)。為了能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)可能的遺傳突變進(jìn)行搜尋，加快功能基因組學(xué)研究的進(jìn)程，人們現(xiàn)已把越來(lái)越多的注意力放到了能同時(shí)提供有關(guān)多個(gè)基因及其序列的所謂并行分子遺傳學(xué)分析方法上。功能基因組學(xué)所研究的是在特定組織中，發(fā)育的不同階段或者是疾病的不同時(shí)期基因的表達(dá)情況。因此它的要求是要能在同一時(shí)刻獲得多個(gè)分子遺傳學(xué)分析的結(jié)果。譬如，許多疾病引發(fā)基因可能會(huì)有數(shù)以百計(jì)的與表征有關(guān)的特定突變。因而，要求能有同時(shí)篩檢這些突變的有效方法。另外，任何一個(gè)細(xì)胞中都會(huì)有上千個(gè)基因在表達(dá)。而細(xì)胞間基因表達(dá)的差異往往能反映出這些細(xì)胞是發(fā)育正常還是在朝惡性腫瘤細(xì)胞方向發(fā)展。采用芯片利用雜交對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的好處是它能用很少的細(xì)胞物質(zhì)便能提供有關(guān)多基因差異表達(dá)的信息，從而給疾病診斷和藥物篩選帶來(lái)了巨大沖擊。Lockhart等人采用基其上固化有由65 000個(gè)不同序列的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷的探針芯片，定量地分析了一個(gè)小鼠T細(xì)胞線(xiàn)中整個(gè)RNA群體中21個(gè)各不相同的信使RNA。這些專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)的探針能與114個(gè)已知的小鼠基因雜交。分析發(fā)現(xiàn)在誘發(fā)生成細(xì)胞分裂后，另有20個(gè)信使RNA的表達(dá)也發(fā)生了改變。檢測(cè)結(jié)果表明該系統(tǒng)對(duì)RNA的檢出率為1∶300 000，對(duì)信使RNA的定量基準(zhǔn)為1∶300。DeRisi等人將一個(gè)惡性腫瘤細(xì)胞線(xiàn)中得到的870個(gè)不同的cDNA探針通過(guò)機(jī)械手“刷印”到載玻片上以觀(guān)察癌基因的表達(dá)情況，在比較兩個(gè)標(biāo)有不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞信使RNA群的雜交結(jié)果之后，他們對(duì)引入正常人染色體后腫瘤基因受到抑制的細(xì)胞中的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行了分析。另外，Shoemaker等人報(bào)道了一種利用生物芯片來(lái)確定許多新近發(fā)現(xiàn)的酵母基因的生物功能的所謂分子條形編碼技術(shù)。這種技術(shù)的好處是它能讓我們以并行的方式定量地分析很復(fù)雜的核酸混合物。
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3 結(jié)尾
以生物芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的另外一個(gè)很有應(yīng)用價(jià)值的研究方向是用生物芯片技術(shù)所具有的高集成度與組合化學(xué)相結(jié)合，為新藥研究的初篩提供超高通量篩選(Ultra-High Throughput Screening)。另外，用生物芯片技術(shù)還可以對(duì)中藥的真?zhèn)魏陀行С煞诌M(jìn)行快速鑒定和分析。在材料上，除了用硅作生物芯片的加工之外，有的研究單位現(xiàn)已開(kāi)始采用塑料成模工藝和彈性體來(lái)加工制作生物芯片。采用塑料或彈性體的好處是生產(chǎn)成本可進(jìn)一步降低，用過(guò)的芯片更便于丟棄處置，樣品和試劑所面臨的表面化學(xué)問(wèn)題更容易得到解決。
作者簡(jiǎn)介：許俊泉(1975～)，男，福建莆田人，碩士。清華大學(xué)生物芯片研究與開(kāi)發(fā)中心。
收稿日期：1999-12-06, 百拇醫(yī)藥