慢性成人牙周炎患者齦溝液谷胱甘肽過氧化物酶的測定
作者:舒婷 黃萍 王暉 張靜儀 張平 陳紅英
單位:舒婷 黃萍 王暉(華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 610041);張靜儀 張平 陳紅英(衛(wèi)生部生物醫(yī) 學工程重點實驗室)
關(guān)鍵詞:牙周炎;齦溝液;谷胱甘肽過氧化物酶;自由基
實用口腔醫(yī)學雜志000210 〔摘要〕 目的:證實齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽過 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在,初步探討其與牙周病的關(guān)系。[ HT5”H 方法:選擇12名牙周健康者(H組)的21個牙位點及23名慢性成人牙周炎 患者(AP組)44個牙位點用DTNB顯色法測定GCF-GPx活性,并記錄AP組GI、PD、AL。結(jié)果:AP組GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明顯低于H組(503.35±304. 36)(P<0.001),AP組GPx活性與PD、AL負相關(guān)(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92,P<0.05)。結(jié)論:GCF-GPx的存在間接提示:牙周炎可能是 局部自由基產(chǎn)生清除失衡的結(jié)果,牙周局部存在著抗氧化能力的下降。證實齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽過 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在,初步探討其與牙周病的關(guān)系。[ HT5”H 方法:選擇12名牙周健康者(H組)的21個牙位點及23名慢性成人牙周炎 患者(AP組)44個牙位點用DTNB顯色法測定GCF-GPx活性,并記錄AP組GI、PD、AL。結(jié)果:AP組GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明顯低于H組(503.35±304. 36)(P<0.001),AP組GPx活性與PD、AL負相關(guān)(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92,P<0.05)。結(jié)論:GCF-GPx的存在間接提示:牙周炎可能是 局部自由基產(chǎn)生清除失衡的結(jié)果,牙周局部存在著抗氧化能力的下降。
, 百拇醫(yī)藥
中圖分類號:R781.4+2 文獻標識碼:A 文章編號:1001-3733(2000)02-0115-03
Glutathione peroxidase activty in gingival crevicular fluid of the patients with chronic adult periodontitis
Su Ting,Huang Ping,Wang Hui
(College of Stomtology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the glutathione peroxidase (GPx) activ ity in gingival crevicular fluid(GCF),and its relationship with chronic periodon titis in adults.Methods:GCF-GPx activity of 12 healthy su bjects (H) and 21 chronic adult periodontitis patients (AP) was determined by DT NB method.GI,PD,AL of AP group were recorded.Results:GCF- GPx activity (U) in group AP and group H were 160.07±121.44 and 503.35±304.36 respectively (P<0.001),that in group AP was negatively correlated with PD an d AL.Conclusion.The imbalance between local free radicals pr oduction and clearance might lead to periodontal disease because of the inabilit y of antioxidation to some extend.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Peridontitis;Gingival crevicular fluid; Glutathione pe roxidase; Free radicals chronic adult
牙周炎發(fā)病因素復雜,現(xiàn)多認為是細菌感染性疾病,牙周致病菌激發(fā)的過度的宿主反應 ,尤其是炎癥反應,是牙周組織破壞的主要原因〔1〕。與身體其它部位炎癥類似 ,局部浸潤的炎癥細胞在“呼吸爆發(fā)”(respiratory burst)過程中將產(chǎn)生大量的氧化產(chǎn)物 〔2〕。自由基(FR)在殺滅微生物的同時,也破壞正常的組織細胞結(jié)構(gòu)。機體內(nèi)有多 種天然的FR清除劑,正常情況下FR的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡,一旦平衡關(guān)系打破,即可導 致病理狀態(tài)。FR已被證實為多種疾病的致病因子,如炎癥、腫瘤、衰老等。
齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中已檢測出多種宿主反應產(chǎn)物。本研究即首次證 實了GCF中FR清除劑-谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)的存在,比較了慢性 成人牙周炎組與牙周健康組GCF-GPx活性的差異,分析了該酶的活性與牙周臨床指標的相關(guān) 性,以初步探討其與牙周炎的關(guān)系。
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1 材料和方法
1.1 對象
臨床確診為慢性成人牙周炎(AP)組23人(男13人,女10人),年齡31~63歲,平均年齡43.8歲 ,皆來自華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周病診室初診患者,選取44個患牙,記錄臨床指標,收集 GCF樣本。牙周健康組(H)組12人(男7人,女5人),年齡31~62歲,平均年齡42.8歲,皆為本 院學生或教職工,選取21個受檢牙。以上納入研究者,無全身系統(tǒng)疾患,3月內(nèi)未使用過抗 生素及其它影響FR的藥物,半年內(nèi)無牙周治療史,婦女未妊娠。
1.2 方法
1.2.1 GCF樣本的采集與處理 隔濕取樣牙,去除齦上菌斑,將專用濾紙條(Periopaper)放 大該牙頰側(cè)近中的牙周袋或齦溝內(nèi),留置30 s后取出(若濾紙條上有血則棄去,重新選牙)。 10 s后在同一位點再次取樣,用齦溝液測量儀(periotron 8000)測得液量后立即將兩張濾紙 條一同放入盛有200 μl生理鹽水的EP管中(齦溝液的總量為兩次之和),置于-20°冰箱內(nèi) 保存待用。1月內(nèi)成批取出,室溫下解凍,漩渦振蕩器上振蕩洗滌,10 000 r/min離心,10 min后取出上清液,測定酶活性。
, 百拇醫(yī)藥
1.2.2 記錄牙周臨床指標 為防止對GCF質(zhì)和量的影響,臨床指標的記錄均在取樣后進行。記錄如下指標:牙齦指數(shù)(GI )、探診深度(PD)、附著喪失(AL)。
1.2.3 GCF-GPx的測定 參照夏奕明等〔3〕的DTNB直接法,在自動微板讀數(shù)儀上測定GCF-GPx活性。
原理:
GPx活力以催化GSH氧化的反 應速度即單位時間內(nèi)GSH減少的量來表示。GSH和5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(縮寫DTNB )反應,在GPx催化下可生成黃色的5-硫代2-硝基苯甲酸陰離子,測定該離子的濃度,即可計 算出GSH減少的量。由于GSH在沒有酶的條件下也能進行氧化(非酶反應),所以最后計算酶的 活性時,必須扣除非酶反應引起的GSH的減少量。
單位定義:每微升GCF在37°反應5 min,扣除非酶反應,使GSH濃度降低1 μmol為1個酶活 單位(U)。
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1.2.4 試劑和操作步驟(略)
2 結(jié) 果
2.1 AP組GCF-GPx活性明顯低于H組(P<0.001)(表1)。
表1 H組與CAP組GCF-GPx活性(U) 分組
n
±s
t
P
H
21
503.35±304.36
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6.5144
<0.001
CAP
44
160.07±121.44
2.2 AP患者GCF-Gpx和各項臨床指標關(guān)系
AP患者GCF-GPx水平與其它各項臨床 指標間的直線相關(guān)分析表明,GCF-GPx水平與GI無相關(guān)關(guān)系(r=-0.0662,P>0.05), 與PD呈弱的負相關(guān)系(r=-3058,P<0.05),與AL的負相關(guān)程度相對較高(r=-0.42 92,P<0.005),說明牙周袋深,附著喪失重者GCF-GPx水平低(表2)。表2 AP患者臨床指標與GCF-GPx相關(guān)關(guān)系 GCF-GPx
臨床指標
, 百拇醫(yī)藥
r
P
GI
-0.0662
>0.05
PD
-0.3058
<0.05
AL
-0.4292
<0.005
3 討 論
近年來,自由基(FR)與牙周病的關(guān)系已日益受到重視〔4〕。本研究采用DTNB顯色法 在健康及炎癥部位GCF中均檢測出了FR清除劑--GPx的活性,這間接反映了局部牙周部位的F R的存在及作用。GPx是一種廣泛存在于機體組織細胞中線粒體、胞漿內(nèi)以及生物膜上的水溶 性四聚蛋白酶,能將H2O2還原為H2O,使得O2通過其中間產(chǎn)物H2O2生成活性最 強的膜氧化劑OH的鏈式反應被打斷,從而保護細胞免受FR損害〔5,6〕。本實驗結(jié)果 顯示,AP組GCF-GPx活性降低,與H組相比差異有高度顯著(P<0.001),說明AP組存在抗 氧化能力的下降,進而增加了對牙周病的易感性。GPx活性降低可能有以下幾個方面的原因 :①牙周致病菌激發(fā)的防御反應過程中局部FR濃度增高,GPx消耗過多;②FR與蛋白質(zhì)中肽 腱、氨基酸殘基及巰基反應,改變了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和酶的活性;③機體缺乏微量元 素Se(GPx酶分子的活性中心)、Vitc、VitE(小分子自由基清除劑,可協(xié)同GPx的抗氧化活性) 等,或是其他未明的全身因素導致GPx生物合成減少或活性降低。
, 百拇醫(yī)藥
Ramfjord〔7〕于1959年首次用附著水平來反應和衡量牙周組織的破壞程度。本研究 發(fā)現(xiàn)GCF-GPx活性與PD,AL等臨床指標負相關(guān),說明牙周袋深,附著水平喪失重者GCF-GPx 活性低,即牙周組織破壞越重者,局部抗氧化能力越低。但本研究尚不能明確GCF-GPx活性 降低是否發(fā)生在牙周組織破壞之前,以及是否有因果關(guān)系,孰因孰果。若想闡明這些問題, 尚需做更深入的研究。作者認為,在牙周炎發(fā)展過程中存在一個“惡性循環(huán)”,菌斑堆積導 致過度的炎癥反應,使局部FR生成增多,GPx大量消耗并被失活,削弱了組織的抗氧化能力 ,于是對牙周炎癥的易感性增加,加速組織的破壞,F(xiàn)R進一步生成。打斷這個惡性循環(huán)如在 菌斑堆積之初即采取措施控制菌斑,和及時補充外源型抗氧化物如Vitc,VitE,β-胡蘿卜 素、微量元素等,應能逆轉(zhuǎn)早期的牙周炎癥。牙周病是自由基失衡的疾病,機體如能自身調(diào) 節(jié)平衡,損傷即可避免。
另外,GPx是如何從線粒體、胞漿內(nèi)及生物膜上進入GCF中的,該機制還不明了。本文做如下 推測∶①FR的產(chǎn)生超過了細胞的清除能力,導致生物膜的損傷,細胞死亡后的非特異性釋放 ;②細胞針對局部增多的FR的應激情況,有選擇地主動釋放GPx。上述推測還需進一步的免 疫組織化學的研究證實。
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參考文獻
1,Lamster IB.Evaluation of components of gingivl crevicular fluid as diag nostic test.Ann Periodontol,1997,2:123
2,Babior BM.Oxidants from phagocytes:Agents of defense and destrcution.Blood,198 4,6:959
3,夏亦明,朱蓮珍.血和組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定方法.衛(wèi)生研究,1987,16(4) :29
4,黃萍,王暉,張?zhí)N惠.牙周病變組織GPx的測定.實用口腔醫(yī)學雜志,1998,14(1):11
5,Charon JA,Mergenhagen SE,Gallin JI.Gingivitis and oral ulceration in patients with neutrophil dysfunction.J Oral Pathol,1985,14:150
6,潘世茂主編.病理生理學進展.北京:人民衛(wèi)生出版社,1987.67~69
7,Ramfjord SP.Indices for prevalence and incidence of periodontal disease.J Per oidontol,1959,30:51
(收稿:1999-06-18 修回:1999-11-29), 百拇醫(yī)藥
單位:舒婷 黃萍 王暉(華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院 610041);張靜儀 張平 陳紅英(衛(wèi)生部生物醫(yī) 學工程重點實驗室)
關(guān)鍵詞:牙周炎;齦溝液;谷胱甘肽過氧化物酶;自由基
實用口腔醫(yī)學雜志000210 〔摘要〕 目的:證實齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽過 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在,初步探討其與牙周病的關(guān)系。[ HT5”H 方法:選擇12名牙周健康者(H組)的21個牙位點及23名慢性成人牙周炎 患者(AP組)44個牙位點用DTNB顯色法測定GCF-GPx活性,并記錄AP組GI、PD、AL。結(jié)果:AP組GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明顯低于H組(503.35±304. 36)(P<0.001),AP組GPx活性與PD、AL負相關(guān)(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92,P<0.05)。結(jié)論:GCF-GPx的存在間接提示:牙周炎可能是 局部自由基產(chǎn)生清除失衡的結(jié)果,牙周局部存在著抗氧化能力的下降。證實齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中谷胱甘肽過 氧化物酶(glutathione peroxida.se,GPx)的存在,初步探討其與牙周病的關(guān)系。[ HT5”H 方法:選擇12名牙周健康者(H組)的21個牙位點及23名慢性成人牙周炎 患者(AP組)44個牙位點用DTNB顯色法測定GCF-GPx活性,并記錄AP組GI、PD、AL。結(jié)果:AP組GCF-GPx活性〔(160.07±121.44)U〕明顯低于H組(503.35±304. 36)(P<0.001),AP組GPx活性與PD、AL負相關(guān)(r=-0.3058,P<0.05 r=-0.42 92,P<0.05)。結(jié)論:GCF-GPx的存在間接提示:牙周炎可能是 局部自由基產(chǎn)生清除失衡的結(jié)果,牙周局部存在著抗氧化能力的下降。
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中圖分類號:R781.4+2 文獻標識碼:A 文章編號:1001-3733(2000)02-0115-03
Glutathione peroxidase activty in gingival crevicular fluid of the patients with chronic adult periodontitis
Su Ting,Huang Ping,Wang Hui
(College of Stomtology,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041)
〔Abstract〕Objective:To study the glutathione peroxidase (GPx) activ ity in gingival crevicular fluid(GCF),and its relationship with chronic periodon titis in adults.Methods:GCF-GPx activity of 12 healthy su bjects (H) and 21 chronic adult periodontitis patients (AP) was determined by DT NB method.GI,PD,AL of AP group were recorded.Results:GCF- GPx activity (U) in group AP and group H were 160.07±121.44 and 503.35±304.36 respectively (P<0.001),that in group AP was negatively correlated with PD an d AL.Conclusion.The imbalance between local free radicals pr oduction and clearance might lead to periodontal disease because of the inabilit y of antioxidation to some extend.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Peridontitis;Gingival crevicular fluid; Glutathione pe roxidase; Free radicals chronic adult
牙周炎發(fā)病因素復雜,現(xiàn)多認為是細菌感染性疾病,牙周致病菌激發(fā)的過度的宿主反應 ,尤其是炎癥反應,是牙周組織破壞的主要原因〔1〕。與身體其它部位炎癥類似 ,局部浸潤的炎癥細胞在“呼吸爆發(fā)”(respiratory burst)過程中將產(chǎn)生大量的氧化產(chǎn)物 〔2〕。自由基(FR)在殺滅微生物的同時,也破壞正常的組織細胞結(jié)構(gòu)。機體內(nèi)有多 種天然的FR清除劑,正常情況下FR的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡,一旦平衡關(guān)系打破,即可導 致病理狀態(tài)。FR已被證實為多種疾病的致病因子,如炎癥、腫瘤、衰老等。
齦溝液(gingival crevicular fluid,GCF)中已檢測出多種宿主反應產(chǎn)物。本研究即首次證 實了GCF中FR清除劑-谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)的存在,比較了慢性 成人牙周炎組與牙周健康組GCF-GPx活性的差異,分析了該酶的活性與牙周臨床指標的相關(guān) 性,以初步探討其與牙周炎的關(guān)系。
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1 材料和方法
1.1 對象
臨床確診為慢性成人牙周炎(AP)組23人(男13人,女10人),年齡31~63歲,平均年齡43.8歲 ,皆來自華西醫(yī)科大學口腔醫(yī)院牙周病診室初診患者,選取44個患牙,記錄臨床指標,收集 GCF樣本。牙周健康組(H)組12人(男7人,女5人),年齡31~62歲,平均年齡42.8歲,皆為本 院學生或教職工,選取21個受檢牙。以上納入研究者,無全身系統(tǒng)疾患,3月內(nèi)未使用過抗 生素及其它影響FR的藥物,半年內(nèi)無牙周治療史,婦女未妊娠。
1.2 方法
1.2.1 GCF樣本的采集與處理 隔濕取樣牙,去除齦上菌斑,將專用濾紙條(Periopaper)放 大該牙頰側(cè)近中的牙周袋或齦溝內(nèi),留置30 s后取出(若濾紙條上有血則棄去,重新選牙)。 10 s后在同一位點再次取樣,用齦溝液測量儀(periotron 8000)測得液量后立即將兩張濾紙 條一同放入盛有200 μl生理鹽水的EP管中(齦溝液的總量為兩次之和),置于-20°冰箱內(nèi) 保存待用。1月內(nèi)成批取出,室溫下解凍,漩渦振蕩器上振蕩洗滌,10 000 r/min離心,10 min后取出上清液,測定酶活性。
, 百拇醫(yī)藥
1.2.2 記錄牙周臨床指標 為防止對GCF質(zhì)和量的影響,臨床指標的記錄均在取樣后進行。記錄如下指標:牙齦指數(shù)(GI )、探診深度(PD)、附著喪失(AL)。
1.2.3 GCF-GPx的測定 參照夏奕明等〔3〕的DTNB直接法,在自動微板讀數(shù)儀上測定GCF-GPx活性。
原理:
單位定義:每微升GCF在37°反應5 min,扣除非酶反應,使GSH濃度降低1 μmol為1個酶活 單位(U)。
, 百拇醫(yī)藥
1.2.4 試劑和操作步驟(略)
2 結(jié) 果
2.1 AP組GCF-GPx活性明顯低于H組(P<0.001)(表1)。
表1 H組與CAP組GCF-GPx活性(U) 分組
n
t
P
H
21
503.35±304.36
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6.5144
<0.001
CAP
44
160.07±121.44
2.2 AP患者GCF-Gpx和各項臨床指標關(guān)系
AP患者GCF-GPx水平與其它各項臨床 指標間的直線相關(guān)分析表明,GCF-GPx水平與GI無相關(guān)關(guān)系(r=-0.0662,P>0.05), 與PD呈弱的負相關(guān)系(r=-3058,P<0.05),與AL的負相關(guān)程度相對較高(r=-0.42 92,P<0.005),說明牙周袋深,附著喪失重者GCF-GPx水平低(表2)。表2 AP患者臨床指標與GCF-GPx相關(guān)關(guān)系 GCF-GPx
臨床指標
, 百拇醫(yī)藥
r
P
GI
-0.0662
>0.05
PD
-0.3058
<0.05
AL
-0.4292
<0.005
3 討 論
近年來,自由基(FR)與牙周病的關(guān)系已日益受到重視〔4〕。本研究采用DTNB顯色法 在健康及炎癥部位GCF中均檢測出了FR清除劑--GPx的活性,這間接反映了局部牙周部位的F R的存在及作用。GPx是一種廣泛存在于機體組織細胞中線粒體、胞漿內(nèi)以及生物膜上的水溶 性四聚蛋白酶,能將H2O2還原為H2O,使得O2通過其中間產(chǎn)物H2O2生成活性最 強的膜氧化劑OH的鏈式反應被打斷,從而保護細胞免受FR損害〔5,6〕。本實驗結(jié)果 顯示,AP組GCF-GPx活性降低,與H組相比差異有高度顯著(P<0.001),說明AP組存在抗 氧化能力的下降,進而增加了對牙周病的易感性。GPx活性降低可能有以下幾個方面的原因 :①牙周致病菌激發(fā)的防御反應過程中局部FR濃度增高,GPx消耗過多;②FR與蛋白質(zhì)中肽 腱、氨基酸殘基及巰基反應,改變了蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和酶的活性;③機體缺乏微量元 素Se(GPx酶分子的活性中心)、Vitc、VitE(小分子自由基清除劑,可協(xié)同GPx的抗氧化活性) 等,或是其他未明的全身因素導致GPx生物合成減少或活性降低。
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Ramfjord〔7〕于1959年首次用附著水平來反應和衡量牙周組織的破壞程度。本研究 發(fā)現(xiàn)GCF-GPx活性與PD,AL等臨床指標負相關(guān),說明牙周袋深,附著水平喪失重者GCF-GPx 活性低,即牙周組織破壞越重者,局部抗氧化能力越低。但本研究尚不能明確GCF-GPx活性 降低是否發(fā)生在牙周組織破壞之前,以及是否有因果關(guān)系,孰因孰果。若想闡明這些問題, 尚需做更深入的研究。作者認為,在牙周炎發(fā)展過程中存在一個“惡性循環(huán)”,菌斑堆積導 致過度的炎癥反應,使局部FR生成增多,GPx大量消耗并被失活,削弱了組織的抗氧化能力 ,于是對牙周炎癥的易感性增加,加速組織的破壞,F(xiàn)R進一步生成。打斷這個惡性循環(huán)如在 菌斑堆積之初即采取措施控制菌斑,和及時補充外源型抗氧化物如Vitc,VitE,β-胡蘿卜 素、微量元素等,應能逆轉(zhuǎn)早期的牙周炎癥。牙周病是自由基失衡的疾病,機體如能自身調(diào) 節(jié)平衡,損傷即可避免。
另外,GPx是如何從線粒體、胞漿內(nèi)及生物膜上進入GCF中的,該機制還不明了。本文做如下 推測∶①FR的產(chǎn)生超過了細胞的清除能力,導致生物膜的損傷,細胞死亡后的非特異性釋放 ;②細胞針對局部增多的FR的應激情況,有選擇地主動釋放GPx。上述推測還需進一步的免 疫組織化學的研究證實。
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參考文獻
1,Lamster IB.Evaluation of components of gingivl crevicular fluid as diag nostic test.Ann Periodontol,1997,2:123
2,Babior BM.Oxidants from phagocytes:Agents of defense and destrcution.Blood,198 4,6:959
3,夏亦明,朱蓮珍.血和組織中谷胱甘肽過氧化物酶活力的測定方法.衛(wèi)生研究,1987,16(4) :29
4,黃萍,王暉,張?zhí)N惠.牙周病變組織GPx的測定.實用口腔醫(yī)學雜志,1998,14(1):11
5,Charon JA,Mergenhagen SE,Gallin JI.Gingivitis and oral ulceration in patients with neutrophil dysfunction.J Oral Pathol,1985,14:150
6,潘世茂主編.病理生理學進展.北京:人民衛(wèi)生出版社,1987.67~69
7,Ramfjord SP.Indices for prevalence and incidence of periodontal disease.J Per oidontol,1959,30:51
(收稿:1999-06-18 修回:1999-11-29), 百拇醫(yī)藥