c-myc反義寡核苷酸對(duì)粘液表皮樣癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用
http://www.www.srpcoatings.com
37c醫(yī)學(xué)網(wǎng)
作者:王石光 司徒鎮(zhèn)強(qiáng) 吳軍正 劉斌
單位:王石光(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院口腔科 510010);司徒鎮(zhèn)強(qiáng) 吳軍正 劉斌(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)
關(guān)鍵詞:粘液表皮樣癌;myc基因;反義寡核苷酸類
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志000520
〔摘要〕 目的:探討c-myc基因的反義寡核苷酸(ASODN)在涎腺粘液表皮 樣癌基因治療中的 作用。方法:人工合成與c-myc基因第二外顯子翻譯起 始區(qū)序列互補(bǔ)的寡核苷酸,處理培養(yǎng) 的人涎腺粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀 檢 測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響;并采用免疫組化法檢測(cè)C-MYC蛋白的表達(dá)。結(jié)果:c-myc反義寡核苷酸 能抑制粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞的增殖,抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴性。50%抑制濃度(IC 50)為8.2 μmol/L。用濃度為10 μmol/L的c-myc ASODN處理72 h,對(duì)MEC-1細(xì) 胞的抑 制率達(dá)59%。c-myc ASODN抑制MEC-1細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期;并能抑制C-MYC蛋白的表 達(dá)。結(jié)論:c-myc反義寡核苷酸對(duì)粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞有特異性抑制 作用。
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中圖分類號(hào):R739.87 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1001-3733(2000)05-0391-03
In vitro inhibitary effects of antisense oligodeoxynucleotides of c-myc gene on mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cells
Wang Shiguang Situ Zhenqiang Wu Junzheng
(Department of Dentistry,General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010)
〔Abstract〕Objective:To investigate the effects of antisense oligode oxynucleoti des (ASODN) of c-myc gene on the growth of human mucoepidermoid carcinoma M EC- 1 cells.Methods:From translation initiation region of seco nd extron of human c-myc gene,15-Mer antisense (ASODN),sense,and mismatche d oligonucleotides were sy nthesized and modified with phosphorothioate.Mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cel ls derived from human salivary gland were treated with c-myc ASODN at vario us c oncentrations.The influence of c-myc ASODN on cell growth and cell cycle di stri bution were analysed with MTT assay and flow-cytometry,respectively.C-MYC prot ein expression was detected with immunohistochemical staining.Results :c-myc ASO DN inhibited MEC-1 cell growth in a dose-and time-dependent manner.The IC 50 value was 8.2 μmol/L.The growth of MEC-1 decreased by 59% when coculture d with 10 μmol/L ASODN for 72 h.c-myc ASODN could increase the cell number i n G1 phase and decrease that in S phase and reduce the C-MYC protein expressi on .Conclusion:c-myc ASODN can inhibit the growth of muc oepidermoid carcinoma MEC-1 cells.
, 百拇醫(yī)藥
Key words Mucoepidermoid carcinoma;myc genes;Antisense oligonucl eotides
c-myc基因是一種與細(xì)胞增殖、分化和調(diào)亡密切相關(guān)的原癌基因。已發(fā)現(xiàn)在粘液表 皮樣 癌細(xì)胞MEC-1細(xì)胞中有c-myc基因的擴(kuò)增〔1〕。為了探討反義基因片段在粘液表 皮樣 癌治療的可能性,我們以MEC-1細(xì)胞為體外模型,初步研究了c-myc基因反義寡核苷酸( ASODN)對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用,F(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞系
人粘液表皮樣癌細(xì)胞系MEC-1(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院建立),在37 ℃、φ(CO2)=5%及飽和濕度條件下,用含φ=10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 寡核苷酸(ODN)的合成和序列
根據(jù)c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)序列設(shè)計(jì)ODN,由加拿大上海 Sangong公司合成并行全硫代磷酸化修飾。正義(sense)序列5'-ATG CCC CTC AAC GTT-3'( SODN);反義(antisense)序列5'-AAC GTT GAG GGG CAT-3';錯(cuò)配(mismatch)序列5'-CAC GTG GAG TGG CAT-3'(MODN)。
1.3 ODN對(duì)細(xì)胞的量效曲線、時(shí)效曲線測(cè)定
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MEC-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 ,每孔接種細(xì)胞2×103個(gè)/0.1 ml。常規(guī)培養(yǎng)至次日,對(duì)照組每孔加培養(yǎng)液0.1 ml ,處理組分別加入含有不同濃度(用新鮮培養(yǎng)液倍比稀釋)的c-myc反義、正義及錯(cuò)配OD N(使 各組終濃度分別為2.5、5、10、20 μmol/L)培養(yǎng)液0.1 ml。每種ODN的各種濃度分別設(shè)4個(gè) 孔, 對(duì)照組設(shè)8個(gè)孔。繼續(xù)在上述常規(guī)下培養(yǎng)72 h,行MTT法測(cè)定光吸收值(A)〔2〕。以 對(duì)照組為100%,計(jì)算出各組A值百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用EXCEL軟件繪制劑量-效應(yīng)曲線。
, 百拇醫(yī)藥
另外,取3塊96孔板,每孔接種細(xì)胞2×103個(gè)/0.1 ml。次日行實(shí)驗(yàn)處理,對(duì)照組每 孔加培養(yǎng)液0.1 ml,處理組分ASODN組、SODN組及MODN組,各組終濃度均為10 μmol/L,每 組4 孔。分別于24、48、72 h各取一塊板,測(cè)A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。
1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
設(shè)對(duì)照組及ASODN處理組。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于25 ml培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。24 h后,處理組加入c-myc ASODN,使終濃度為10 μmol/L。ASODN處理7 2 h后,各組細(xì)胞以2.5 g/L胰酶消化,按常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。
1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于事先放置有小玻片的小培養(yǎng)皿中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,加入 c-myc ASODN(終濃度為 10 μmol/L)。72 h后,按常規(guī)ABC免疫組化法染色(ABC試 劑盒為美國(guó)V ectuo公司產(chǎn)品;c-myc單抗購(gòu)自華美生物工程公司,工作濃度1∶50),光鏡下觀察。 結(jié)果判定: 未著色的細(xì)胞定為陰性細(xì)胞,陽性細(xì)胞核呈棕黃色,邊界清楚,胞漿無染色。在油鏡下取隨 機(jī)視野連續(xù)不遺漏計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)C-MYC蛋白表達(dá)陽性率。
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2 結(jié) 果
2.1 3種ODN對(duì)細(xì)胞抑制作用的劑量-效應(yīng)曲線
見圖1。50%抑制濃度(IC50)為 8.2 μmol/L。
2.2 3種ODN對(duì)細(xì)胞抑制作用的時(shí)間-效應(yīng)曲線
見圖2。
2.3 c-myc ASODN對(duì)細(xì)胞周期的影響
見表1。
2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)C-MYC蛋白表達(dá)
對(duì)照組MEC-1細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色后鏡檢發(fā)現(xiàn),約63%的細(xì)胞核明顯染色,說明細(xì)胞 有明顯的C-MYC蛋白表達(dá)。而ASODN處理組細(xì)胞陽性率為21%,且胞核著色較淡。
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圖1 3種寡核苷酸對(duì)MEC-1細(xì)胞作用的劑量-效應(yīng)曲線
圖2 3種寡核苷酸對(duì)MEC-1細(xì)胞作用的時(shí)間-效應(yīng)曲線
表1 ASODN對(duì)細(xì)胞周期的影響 實(shí)驗(yàn)分組
各期細(xì)胞數(shù)(%)
G1
S
G2
對(duì)照
47.2
38.1
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14.6
ASODN
67.2
21.2
11.6
3 討 論
作為一種新的可能的治療手段,基因治療日益受到關(guān)注。基因的反義寡核苷酸(ASODN)具有 封閉(抑制)特定有害基因表達(dá)的作用,因而ASODN治療成為近年來發(fā)展起來的基因治療的一 項(xiàng)重要技術(shù)。c-myc基因作為生長(zhǎng)因子的“即刻早期反應(yīng)基因”,其產(chǎn)物是參與細(xì)胞周 期調(diào) 控的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,是細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期所必需的〔3〕。c-myc基因的 過度 表達(dá),可以改變細(xì)胞內(nèi)的基因調(diào)控,使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化為惡性表型,其它癌基因的活化或抗癌 基因的失活均可加速腫瘤的發(fā)生〔4〕。在粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞中有c-myc 基因 的擴(kuò)增,提示c-myc基因可能與粘液表皮樣癌的發(fā)生〔5〕有關(guān)。因此,通過阻 斷c-myc基 因的表達(dá),有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程。Watson等〔5〕利用c-myc AS ODN抑 制乳腺癌c-myc表達(dá),從而使乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。Cerutti等〔6〕 用c-myc有效地抑制了7株有c-myc高表達(dá)的甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)c- myc的表達(dá)越高,ASO DN的抑制作用越強(qiáng)。
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本研究設(shè)計(jì)合成了與c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)序列互補(bǔ)的15聚反義寡核苷酸( 同時(shí)設(shè) 計(jì)合成SODN、MODN作對(duì)照),并行硫代磷酸化修飾,觀察了其對(duì)人粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞 的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)c-myc ASODN作用,細(xì)胞中C-MYC蛋白產(chǎn)物表達(dá)受到一 定程度的抑 制,與此相伴隨,細(xì)胞增殖被抑制。抑制作用隨ASODN濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng), 有劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。用濃度為10 μmol/L的c-myc ASODN處理72 h,可使MEC -1細(xì) 胞的抑制率達(dá)59%,而SODN及MODN對(duì)MEC-1細(xì)胞的抑制率很低。表明c-myc ASODN具有 良好 的序列特異性抑制作用,而SODN及MODN只具有對(duì)MEC-1細(xì)胞的非特異性作用,且作用不明 顯。流式細(xì)胞儀能迅速分析細(xì)胞群中各細(xì)胞周期時(shí)相的組成,其中S期百分率常作為比較細(xì) 胞增殖活性的指標(biāo)。結(jié)果顯示,經(jīng)ASODN作用后的MEC-1細(xì)胞,G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多,S期 細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示c-myc ASODN可有效地延緩細(xì)胞由G1期向S期的過渡。表明 c-myc AS ODN具有細(xì)胞周期特異性抑制細(xì)胞增殖的作用。以上結(jié)果提示c-myc ASODN是一種MEC- 1細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制劑,推測(cè)在將來治療粘液表皮樣癌中,c-myc基因有可能成為ASODN基因 治療策略中的許多靶(目的)基因中的一員。
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參考文獻(xiàn)
1,司徒鎮(zhèn)強(qiáng),吳軍正,薛輝.口腔頜面部癌瘤細(xì)胞系c-myc、c-Ha -ras癌基因擴(kuò)增的研究.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志,1992,8:116
2,吳軍正,司徒鎮(zhèn)強(qiáng),劉斌.MTT試驗(yàn)及其在抗癌中藥篩選中的應(yīng)用.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志,199 2,27:373
3,Hunter T.Oncoprotein networks.Cell,1997,88:333
4,Evan GI,Wyllie AH,Glibert CS,et al.Induction of apoptosis in fibroblasts b y c-myc protein.Cell,1992,69:119
5,Watson PH,Pon RT,Shiu RP.Inhibition of c-myc expression by phosphothioate ant i sense oligonucltide identifies a critical role for c-myc in the growth of human breast cancer.Cancer Res,1991,51:3996
6,Cerutti J,Trapasso F,Battaglia,C,et al.Block of c-myc expression by antis ense oligonucleotides inhibits proliferation of human thyroid carcinoma cell lines.Cl in Cancer Res,1996,2:119
(收稿:2000-04-19), 百拇醫(yī)藥
單位:王石光(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院口腔科 510010);司徒鎮(zhèn)強(qiáng) 吳軍正 劉斌(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院)
關(guān)鍵詞:粘液表皮樣癌;myc基因;反義寡核苷酸類
實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志000520
〔摘要〕 目的:探討c-myc基因的反義寡核苷酸(ASODN)在涎腺粘液表皮 樣癌基因治療中的 作用。方法:人工合成與c-myc基因第二外顯子翻譯起 始區(qū)序列互補(bǔ)的寡核苷酸,處理培養(yǎng) 的人涎腺粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞。應(yīng)用MTT比色法觀察其對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀 檢 測(cè)對(duì)細(xì)胞周期的影響;并采用免疫組化法檢測(cè)C-MYC蛋白的表達(dá)。結(jié)果:c-myc反義寡核苷酸 能抑制粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞的增殖,抑制作用具有濃度及時(shí)間依賴性。50%抑制濃度(IC 50)為8.2 μmol/L。用濃度為10 μmol/L的c-myc ASODN處理72 h,對(duì)MEC-1細(xì) 胞的抑 制率達(dá)59%。c-myc ASODN抑制MEC-1細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期;并能抑制C-MYC蛋白的表 達(dá)。結(jié)論:c-myc反義寡核苷酸對(duì)粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞有特異性抑制 作用。
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中圖分類號(hào):R739.87 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1001-3733(2000)05-0391-03
In vitro inhibitary effects of antisense oligodeoxynucleotides of c-myc gene on mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cells
Wang Shiguang Situ Zhenqiang Wu Junzheng
(Department of Dentistry,General Hospital of Guangzhou Military District,Guangzhou 510010)
〔Abstract〕Objective:To investigate the effects of antisense oligode oxynucleoti des (ASODN) of c-myc gene on the growth of human mucoepidermoid carcinoma M EC- 1 cells.Methods:From translation initiation region of seco nd extron of human c-myc gene,15-Mer antisense (ASODN),sense,and mismatche d oligonucleotides were sy nthesized and modified with phosphorothioate.Mucoepidermoid carcinoma MEC-1 cel ls derived from human salivary gland were treated with c-myc ASODN at vario us c oncentrations.The influence of c-myc ASODN on cell growth and cell cycle di stri bution were analysed with MTT assay and flow-cytometry,respectively.C-MYC prot ein expression was detected with immunohistochemical staining.Results :c-myc ASO DN inhibited MEC-1 cell growth in a dose-and time-dependent manner.The IC 50 value was 8.2 μmol/L.The growth of MEC-1 decreased by 59% when coculture d with 10 μmol/L ASODN for 72 h.c-myc ASODN could increase the cell number i n G1 phase and decrease that in S phase and reduce the C-MYC protein expressi on .Conclusion:c-myc ASODN can inhibit the growth of muc oepidermoid carcinoma MEC-1 cells.
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Key words Mucoepidermoid carcinoma;myc genes;Antisense oligonucl eotides
c-myc基因是一種與細(xì)胞增殖、分化和調(diào)亡密切相關(guān)的原癌基因。已發(fā)現(xiàn)在粘液表 皮樣 癌細(xì)胞MEC-1細(xì)胞中有c-myc基因的擴(kuò)增〔1〕。為了探討反義基因片段在粘液表 皮樣 癌治療的可能性,我們以MEC-1細(xì)胞為體外模型,初步研究了c-myc基因反義寡核苷酸( ASODN)對(duì)其生長(zhǎng)的抑制作用,F(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 細(xì)胞系
人粘液表皮樣癌細(xì)胞系MEC-1(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院建立),在37 ℃、φ(CO2)=5%及飽和濕度條件下,用含φ=10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。
, 百拇醫(yī)藥
1.2 寡核苷酸(ODN)的合成和序列
根據(jù)c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)序列設(shè)計(jì)ODN,由加拿大上海 Sangong公司合成并行全硫代磷酸化修飾。正義(sense)序列5'-ATG CCC CTC AAC GTT-3'( SODN);反義(antisense)序列5'-AAC GTT GAG GGG CAT-3';錯(cuò)配(mismatch)序列5'-CAC GTG GAG TGG CAT-3'(MODN)。
1.3 ODN對(duì)細(xì)胞的量效曲線、時(shí)效曲線測(cè)定
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MEC-1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板 ,每孔接種細(xì)胞2×103個(gè)/0.1 ml。常規(guī)培養(yǎng)至次日,對(duì)照組每孔加培養(yǎng)液0.1 ml ,處理組分別加入含有不同濃度(用新鮮培養(yǎng)液倍比稀釋)的c-myc反義、正義及錯(cuò)配OD N(使 各組終濃度分別為2.5、5、10、20 μmol/L)培養(yǎng)液0.1 ml。每種ODN的各種濃度分別設(shè)4個(gè) 孔, 對(duì)照組設(shè)8個(gè)孔。繼續(xù)在上述常規(guī)下培養(yǎng)72 h,行MTT法測(cè)定光吸收值(A)〔2〕。以 對(duì)照組為100%,計(jì)算出各組A值百分比。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用EXCEL軟件繪制劑量-效應(yīng)曲線。
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另外,取3塊96孔板,每孔接種細(xì)胞2×103個(gè)/0.1 ml。次日行實(shí)驗(yàn)處理,對(duì)照組每 孔加培養(yǎng)液0.1 ml,處理組分ASODN組、SODN組及MODN組,各組終濃度均為10 μmol/L,每 組4 孔。分別于24、48、72 h各取一塊板,測(cè)A值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。
1.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期
設(shè)對(duì)照組及ASODN處理組。接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞于25 ml培 養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。24 h后,處理組加入c-myc ASODN,使終濃度為10 μmol/L。ASODN處理7 2 h后,各組細(xì)胞以2.5 g/L胰酶消化,按常規(guī)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期。
1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色
取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于事先放置有小玻片的小培養(yǎng)皿中,常規(guī)培養(yǎng)24 h后,加入 c-myc ASODN(終濃度為 10 μmol/L)。72 h后,按常規(guī)ABC免疫組化法染色(ABC試 劑盒為美國(guó)V ectuo公司產(chǎn)品;c-myc單抗購(gòu)自華美生物工程公司,工作濃度1∶50),光鏡下觀察。 結(jié)果判定: 未著色的細(xì)胞定為陰性細(xì)胞,陽性細(xì)胞核呈棕黃色,邊界清楚,胞漿無染色。在油鏡下取隨 機(jī)視野連續(xù)不遺漏計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)C-MYC蛋白表達(dá)陽性率。
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2 結(jié) 果
2.1 3種ODN對(duì)細(xì)胞抑制作用的劑量-效應(yīng)曲線
見圖1。50%抑制濃度(IC50)為 8.2 μmol/L。
2.2 3種ODN對(duì)細(xì)胞抑制作用的時(shí)間-效應(yīng)曲線
見圖2。
2.3 c-myc ASODN對(duì)細(xì)胞周期的影響
見表1。
2.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)C-MYC蛋白表達(dá)
對(duì)照組MEC-1細(xì)胞,用免疫細(xì)胞化學(xué)染色后鏡檢發(fā)現(xiàn),約63%的細(xì)胞核明顯染色,說明細(xì)胞 有明顯的C-MYC蛋白表達(dá)。而ASODN處理組細(xì)胞陽性率為21%,且胞核著色較淡。
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圖1 3種寡核苷酸對(duì)MEC-1細(xì)胞作用的劑量-效應(yīng)曲線
圖2 3種寡核苷酸對(duì)MEC-1細(xì)胞作用的時(shí)間-效應(yīng)曲線
表1 ASODN對(duì)細(xì)胞周期的影響 實(shí)驗(yàn)分組
各期細(xì)胞數(shù)(%)
G1
S
G2
對(duì)照
47.2
38.1
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14.6
ASODN
67.2
21.2
11.6
3 討 論
作為一種新的可能的治療手段,基因治療日益受到關(guān)注。基因的反義寡核苷酸(ASODN)具有 封閉(抑制)特定有害基因表達(dá)的作用,因而ASODN治療成為近年來發(fā)展起來的基因治療的一 項(xiàng)重要技術(shù)。c-myc基因作為生長(zhǎng)因子的“即刻早期反應(yīng)基因”,其產(chǎn)物是參與細(xì)胞周 期調(diào) 控的最重要的轉(zhuǎn)錄因子,是細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期所必需的〔3〕。c-myc基因的 過度 表達(dá),可以改變細(xì)胞內(nèi)的基因調(diào)控,使細(xì)胞易于轉(zhuǎn)化為惡性表型,其它癌基因的活化或抗癌 基因的失活均可加速腫瘤的發(fā)生〔4〕。在粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞中有c-myc 基因 的擴(kuò)增,提示c-myc基因可能與粘液表皮樣癌的發(fā)生〔5〕有關(guān)。因此,通過阻 斷c-myc基 因的表達(dá),有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程。Watson等〔5〕利用c-myc AS ODN抑 制乳腺癌c-myc表達(dá),從而使乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯的抑制。Cerutti等〔6〕 用c-myc有效地抑制了7株有c-myc高表達(dá)的甲狀腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)c- myc的表達(dá)越高,ASO DN的抑制作用越強(qiáng)。
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本研究設(shè)計(jì)合成了與c-myc基因第二外顯子翻譯起始區(qū)序列互補(bǔ)的15聚反義寡核苷酸( 同時(shí)設(shè) 計(jì)合成SODN、MODN作對(duì)照),并行硫代磷酸化修飾,觀察了其對(duì)人粘液表皮樣癌MEC-1細(xì)胞 的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)c-myc ASODN作用,細(xì)胞中C-MYC蛋白產(chǎn)物表達(dá)受到一 定程度的抑 制,與此相伴隨,細(xì)胞增殖被抑制。抑制作用隨ASODN濃度增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng), 有劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。用濃度為10 μmol/L的c-myc ASODN處理72 h,可使MEC -1細(xì) 胞的抑制率達(dá)59%,而SODN及MODN對(duì)MEC-1細(xì)胞的抑制率很低。表明c-myc ASODN具有 良好 的序列特異性抑制作用,而SODN及MODN只具有對(duì)MEC-1細(xì)胞的非特異性作用,且作用不明 顯。流式細(xì)胞儀能迅速分析細(xì)胞群中各細(xì)胞周期時(shí)相的組成,其中S期百分率常作為比較細(xì) 胞增殖活性的指標(biāo)。結(jié)果顯示,經(jīng)ASODN作用后的MEC-1細(xì)胞,G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多,S期 細(xì)胞數(shù)明顯減少,提示c-myc ASODN可有效地延緩細(xì)胞由G1期向S期的過渡。表明 c-myc AS ODN具有細(xì)胞周期特異性抑制細(xì)胞增殖的作用。以上結(jié)果提示c-myc ASODN是一種MEC- 1細(xì) 胞的生長(zhǎng)抑制劑,推測(cè)在將來治療粘液表皮樣癌中,c-myc基因有可能成為ASODN基因 治療策略中的許多靶(目的)基因中的一員。
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參考文獻(xiàn)
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(收稿:2000-04-19), 百拇醫(yī)藥