實(shí)驗(yàn)性口腔癌變模型中端粒酶的研究
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37c醫(yī)學(xué)網(wǎng)
作者：毛祖彝 高志 徐平平 左暉 何永文
單位：毛祖彝(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；高志(第四軍醫(yī)大學(xué)博士后流動(dòng)站)；徐平平(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；左暉(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；何永文(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)
關(guān)鍵詞：癌變； 端粒酶活性； 頰囊
華西口腔醫(yī)學(xué)雜志000115 摘 要：目的:分析能合成端粒DNA重復(fù)序列的端粒酶在DMBA誘導(dǎo)金黃地鼠頰囊癌變動(dòng)態(tài)過程中的動(dòng)態(tài)變化。方法:采用PCR基礎(chǔ)上的端粒DNA重復(fù)序列擴(kuò)增法和ELISA酶免疫技術(shù),測(cè)定頰囊癌變組織端粒酶動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果:在誘癌過程中,頰囊粘膜組織端粒酶活性隨組織病理學(xué)改變向惡性轉(zhuǎn)化而增高,與自身對(duì)照相比較有顯著差異,其升高在誘癌后期最明顯。結(jié)論:端粒酶激活是腫瘤形成的早期分子標(biāo)志,也是端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定的主要因素。
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Indentification of Telomerase Activity in the Experimental Carcinogenesis of Oral Cavity
Mao Zuyi Gao Zhi Xu Pingping, et al
(Department of Oral Maxillofacial Surgery, College of Stomatology,West China University of Medical Sciences)
Abstract：Objective：Telomerase is a ribonucleoprotien enzyme which synthesizes telomere DNA repeat sequences and maintain stably telomere length. The activity of telomerase may be necessary for the growth of immortalized cells overcoming cellular senescence. The researches have shown that telomerase activities are associated with most cancers. The purpose of the study is to detect the development of telomerase activity during golden hamster cheek pouch carcinogenesis induced by DMBA. Methods: First, 52 golden hamsters were divided into 2 groups. Four of them weren't done any special treatment and were killed after 3 days. The others were covered with DMBA on the surface of cheek pouch on one side in order to induce carcinogenesis, the other side of cheek pouch was treated as the control. Then, the 48 golden hamsters were divided into 4 groups and were killed in 7, 10, 14 and 20 weeks. The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) based on PCR and ELISA was used to analysis the activity of telomerase. Results: ①The expression of telomerase activity existed in normal cheek pouch mucosa of golden hamsters, which meant that telomerase played an important role on controlling cell proliferation. ②The level of telomerase activity gradually increased while hyperplasia and dysplasia was observed in the cheek pouch mucosa covered with DMBA. It reached its top at a later premalignant period and gradually decreased after that. ③There was negative correlation between the degree the telomere length was shortened and the activity of telomerase (r=-0.9654), and there was positive correlation between the reduced rate of telomere length and the activity of telomerase (r=0.9471). Conclusion: The activity of telomerase is one of important factors that can effect the stability of telomere length and plays a crucial role in the progression of oral cancer. So the activity of telomerase is an early molecular marker of carcinogenesis.
, 百拇醫(yī)藥
Key words：carcinogenesis telomerase activity cheek pouch▲
近年來的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的增殖與凋亡受染色體末端結(jié)構(gòu)端粒長(zhǎng)度控制,當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到一定時(shí),染色體穩(wěn)定性降低,可能出現(xiàn)融合、重組甚至分解,導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂增殖而進(jìn)入凋亡。而端粒酶是一種能添加端粒DNA重復(fù)序列至染色體末端的核糖核酸蛋白酶,它具有類似逆轉(zhuǎn)錄酶功能,可以自身RNA為模板合成端粒DNA重復(fù)序列,并轉(zhuǎn)接到染色體3′末端,維持端粒長(zhǎng)度[1,2]。研究表明,大多數(shù)正常組織和體細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性難測(cè)到(陽性率僅4%左右)。但端粒酶與惡性腫瘤發(fā)生有密切相關(guān)性。Kim等[3]和Counter等[4]研究報(bào)道，112種惡性腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織端粒酶活性陽性率高達(dá)85%以上。在正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中，細(xì)胞端粒長(zhǎng)度明顯縮短，而端粒酶激活使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長(zhǎng)度，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞無限增殖，成為永生不死細(xì)胞(immortal cell)。目前對(duì)于端粒酶激活以及調(diào)控機(jī)理還認(rèn)識(shí)不清。1994年Kim等[3]首次報(bào)道了結(jié)合PCR技術(shù)測(cè)端粒酶活性的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP),這使測(cè)定各種組織端粒酶活性成為可能。本研究首次應(yīng)用PCR-TRAP法結(jié)合ELISA分析法，半定量測(cè)定金黃地鼠頰囊癌變過程中的端粒酶動(dòng)態(tài)改變，結(jié)合端粒長(zhǎng)度變化，分析和了解端粒酶在癌變過程中的作用，并為進(jìn)一步研究針對(duì)端粒酶的腫瘤基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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1 材料和方法
1.1 主要試劑與設(shè)備
二甲基苯并蒽(DMBA,Sigma公司,美國(guó)),5′-(CCCTAA)4-3′寡核苷酸探針(北京賽百盛公司),考馬斯亮藍(lán)染料(Sigma公司),端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)藥盒(Boehringer Mannheinn公司),GeneAmp PCR 9600 Thermal Cycler(BIO-RAD公司),SHZ-22水浴恒溫振蕩器(江蘇省太倉(cāng)醫(yī)療器械廠),EL312 microplate Bio-Kinetics reader(美國(guó))。
1.2 金黃地鼠頰囊癌變動(dòng)物模型建立
用DMBA誘導(dǎo)，參見參考文獻(xiàn)[5]。
1.3 金黃地鼠頰囊粘膜組織端粒長(zhǎng)度測(cè)定
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Southern雜交法參見參考文獻(xiàn)[5]。
1.4 金黃地鼠頰囊粘膜組織端粒酶活性檢測(cè)
1.4.1 原理 考馬斯亮藍(lán)染色確定檢測(cè)樣本含端粒酶蛋白量，利用端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄功能，作用其底物(telomerase substrate，TS)，合成端粒重復(fù)序列TTAGGG，以此作為數(shù)目不等的模板，再經(jīng)PCR循環(huán)擴(kuò)增，放大端粒酶功能活性，用高靈敏度、非放射性的ELISA方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物量，設(shè)定陽性和陰性對(duì)照,以O(shè)D值作比較，判定端粒酶活性。
1.4.2 操作步驟 按端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)藥盒說明進(jìn)行，檢測(cè)樣本端粒酶蛋白量確定為1 μg/μl，在EL312e Microplate讀數(shù)儀上測(cè)定OD值，以此判定端粒酶活性。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所測(cè)定的數(shù)據(jù),采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行各組差異分析,采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
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2 結(jié) 果
2.1 金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒酶動(dòng)態(tài)變化觀察
金黃地鼠頰囊癌變過程中不同時(shí)期的端粒酶活性O(shè)D值結(jié)果見表1。每次檢測(cè)以藥盒提供的陽性對(duì)照(胚胎腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞)和煮沸法產(chǎn)生的陰性對(duì)照做ELISA檢測(cè)顯色反應(yīng)，其OD值分別為：0.580±0.015和0.046±0.00352以此作端粒酶活性陰陽性標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)樣本OD值除以陰性對(duì)照OD值大于等于2時(shí)判定為陽性例，并以樣本OD值除以陽性對(duì)照OD值計(jì)算相對(duì)端粒酶活性值，其結(jié)果見表2。
表1 地鼠頰囊癌變過程中不同時(shí)期的
端粒酶活性O(shè)D值 組別
例
數(shù)
, http://www.www.srpcoatings.com 涂藥側(cè)
自身對(duì)照側(cè)
范圍
±s
范圍±s
第7周
6
0.161
～0.441
0.318
±0.124
0.089
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～0.097
0.093
±0.004
第10周
6
0.400
～0.876
0.603
±0.189
0.090
～0.106
0.098
±0.0035
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第14周
6
0.679
～1.337
1.085
±0.245
0.085
～0.095
0.091
±0.0025
第20周
6
0.623
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～1.118
0.869
±0.213
0.094
～0.103
0.097
±0.0043
表2 地鼠頰囊癌變過程中相對(duì)端粒酶活性值 組別
陽性例數(shù)
相對(duì)端粒酶活性值(±s)
涂藥側(cè)
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自身對(duì)照側(cè)
涂藥側(cè)
自身對(duì)照側(cè)
第7周
1
0
0.438±0.175
0.159±0.0037
第10周
3
1
0.919±0.142
0.165±0.0310
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第14周
6
0
1.771±0.217
0.150±0.0023
第20周
6
1
1.398±0.194
0.163±0.0041
2.2 金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒長(zhǎng)度變化與端粒酶活性觀察
金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒長(zhǎng)度變化、長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性結(jié)果見表3。把癌變過程中,涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度與端粒酶活性做相關(guān)分析可得到兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9654),涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性相關(guān)分析,可得到兩者呈正相關(guān)(r=0.9471)。表3 地鼠誘癌過程中各組涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度、長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果 組別
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TRF平均長(zhǎng)度
(±s,kb)
長(zhǎng)度縮短速率
相對(duì)端粒酶活性
(±s)
第7周
13.2±1.93
0.1372
0.438±0.142
第10周
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12.3±1.75
0.1745
0.919±0.172
第14周
8.3±2.72
0.3985
1.771±0.271
第20周
10.7±2.34
0.1445
1.398±0.194
3 討 論
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1994年Kim首創(chuàng)高靈敏度的端粒酶重復(fù)擴(kuò)增法，使人們有可能更多地注意到了端粒酶與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，也使Harley等[6]1990年提出的“端粒假說”成為癌變機(jī)制的重要理論假說有了一系列可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。假說認(rèn)為端粒酶的活化是細(xì)胞走向永生化必需條件，即為惡性腫瘤形成的必需步驟，因此研究癌變過程中組織端粒酶的變化顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)研究了較為理想的一種口腔癌變動(dòng)物模型的端粒酶活性變化，首次探討了端粒酶與口腔癌變機(jī)理的關(guān)系。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常金黃地鼠頰囊粘膜組織內(nèi)也呈現(xiàn)出一定水平的端粒酶活性，相當(dāng)于HEK293細(xì)胞陽性對(duì)照的16%左右。Bacchetti等[7]采用實(shí)驗(yàn)用大鼠的正常腺體、肝、腎等做端粒酶檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)有一定端粒酶活性存在，并認(rèn)為這與這些鼠組織細(xì)胞增生活躍有關(guān)。而頰囊粘膜細(xì)胞也具有高度分裂增殖和不斷更新的能力，它們可表達(dá)一定水平的端粒酶，說明端粒酶對(duì)細(xì)胞增生、發(fā)育起重要調(diào)控作用。為了客觀地分析端粒酶在DMBA誘發(fā)的金黃地鼠頰囊癌變過程中的變化，作者設(shè)定了涂藥對(duì)側(cè)為自身對(duì)照，消除正常粘膜細(xì)胞本身的端粒酶活性表達(dá)的影響，使結(jié)果可靠。
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本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)法，半定量地測(cè)定端粒酶活性。此方法比現(xiàn)有常用的Kim端粒重復(fù)擴(kuò)增法具有一定優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度與同位素的TRAP法相當(dāng)，但無使用同位素的危險(xiǎn)，節(jié)省試劑和時(shí)間，減少污染機(jī)會(huì)，是一高靈敏度的非放射性光度酶免疫檢測(cè)方法。用此方法檢測(cè)的端粒酶在金黃地鼠頰囊癌變過程中的結(jié)果表明，隨著頰囊粘膜組織細(xì)胞的分裂增殖和異常增生，端粒酶活性逐步升高，與自身對(duì)照比較有顯著差異，涂藥側(cè)明顯高于對(duì)照側(cè)(P<0.05)。當(dāng)誘癌過程進(jìn)入第14周非典型增生和原位癌期，其端粒酶活性水平為最高，達(dá)到HEK293細(xì)胞的177%，癌形成期次之，而第7周單純?cè)錾诙肆Ｃ富钚猿嗜蹶栃裕贿_(dá)到HEK293細(xì)胞的43.8%，這說明端粒酶在誘癌過程后期變化明顯。酶活性水平較高，也表明此期間頰囊粘膜組織內(nèi)端粒酶陽性表達(dá)細(xì)胞增多，而這一細(xì)胞亞群就具備了進(jìn)一步分裂增殖向永生化發(fā)展(即惡性轉(zhuǎn)化)的必需條件，正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變。Bednarek等[8]在用TAP誘發(fā)鼠皮膚乳突狀瘤的動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)初期(10周)，11例中僅有1例表達(dá)端粒酶活性，而20周后，表達(dá)端粒酶活性的例數(shù)增多，到30周達(dá)到100%。他們這一結(jié)果與誘導(dǎo)組織細(xì)胞的組織病理學(xué)改變有關(guān)，在初期細(xì)胞處于整二倍體，分化較好時(shí)，細(xì)胞分裂增殖有序，當(dāng)細(xì)胞成為非整倍體細(xì)胞異常增生時(shí)，則端粒酶活性水平逐漸增高，而端粒酶的活化可快速形成補(bǔ)充細(xì)胞染色體端粒DNA重復(fù)片段，維持端粒一定長(zhǎng)度，促使細(xì)胞進(jìn)入無限增殖。
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本實(shí)驗(yàn)研究還將地鼠頰囊癌變中粘膜組織端粒長(zhǎng)度的動(dòng)態(tài)變化與端粒酶活性變化進(jìn)行相關(guān)分析研究。結(jié)果表明：相互對(duì)應(yīng)的誘癌時(shí)期內(nèi)，端粒長(zhǎng)度縮短與端粒酶活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9654)，但其端粒長(zhǎng)度縮短的速率卻與端粒酶活性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.9471)，這證明在金黃地鼠頰囊粘膜細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度改變的調(diào)控,主要受端粒酶活性影響，細(xì)胞依賴于端粒酶活化使端粒維持一定長(zhǎng)度，從而具備無限增殖、逃避凋亡的能力，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。結(jié)果還表明.金黃地鼠頰囊癌變過程中，端粒長(zhǎng)度變化最大期與端粒酶活性表達(dá)最高期是吻合的，都處于癌變過程的良性向惡性轉(zhuǎn)變的時(shí)期，這進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)端粒異�？s短,可引起染色體穩(wěn)定性降低，位于其上的原癌基因和抑癌基因激活、突變、缺失，導(dǎo)致端粒酶激活和表達(dá)增多，使端粒DNA得到迅速補(bǔ)充，細(xì)胞染色體趨于穩(wěn)定，分裂增殖繼續(xù)，細(xì)胞無限增殖轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，癌腫形成。因此端粒酶活性升高，亦是地鼠頰囊粘膜癌變的一個(gè)早期分子指標(biāo)。
綜上所述，DMBA誘發(fā)的金黃地鼠頰囊癌變模型中，端粒酶活性隨著誘癌時(shí)間延長(zhǎng)，組織病理學(xué)改變向惡性轉(zhuǎn)化而增高，與自身對(duì)照相比較有顯著差異。端粒酶活性升高可作為癌變的早期診斷指標(biāo)，同時(shí)也是端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定的主要因素，因此本動(dòng)物模型可作為針對(duì)抑制端粒酶、實(shí)現(xiàn)阻斷和逆轉(zhuǎn)癌變、達(dá)到治療口腔惡性腫瘤目的的較理想模型，為深入研究、發(fā)展頭頸腫瘤的基因診斷和治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)�！�
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基金項(xiàng)目：本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào) 39670788)
參考文獻(xiàn)：
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收稿日期：1998-12-01
修稿日期：1999-11-20, 百拇醫(yī)藥
單位：毛祖彝(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；高志(第四軍醫(yī)大學(xué)博士后流動(dòng)站)；徐平平(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；左暉(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)；何永文(華西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院 610041)
關(guān)鍵詞：癌變； 端粒酶活性； 頰囊
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Mao Zuyi Gao Zhi Xu Pingping, et al
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Abstract：Objective：Telomerase is a ribonucleoprotien enzyme which synthesizes telomere DNA repeat sequences and maintain stably telomere length. The activity of telomerase may be necessary for the growth of immortalized cells overcoming cellular senescence. The researches have shown that telomerase activities are associated with most cancers. The purpose of the study is to detect the development of telomerase activity during golden hamster cheek pouch carcinogenesis induced by DMBA. Methods: First, 52 golden hamsters were divided into 2 groups. Four of them weren't done any special treatment and were killed after 3 days. The others were covered with DMBA on the surface of cheek pouch on one side in order to induce carcinogenesis, the other side of cheek pouch was treated as the control. Then, the 48 golden hamsters were divided into 4 groups and were killed in 7, 10, 14 and 20 weeks. The telomeric repeat amplification protocol (TRAP) based on PCR and ELISA was used to analysis the activity of telomerase. Results: ①The expression of telomerase activity existed in normal cheek pouch mucosa of golden hamsters, which meant that telomerase played an important role on controlling cell proliferation. ②The level of telomerase activity gradually increased while hyperplasia and dysplasia was observed in the cheek pouch mucosa covered with DMBA. It reached its top at a later premalignant period and gradually decreased after that. ③There was negative correlation between the degree the telomere length was shortened and the activity of telomerase (r=-0.9654), and there was positive correlation between the reduced rate of telomere length and the activity of telomerase (r=0.9471). Conclusion: The activity of telomerase is one of important factors that can effect the stability of telomere length and plays a crucial role in the progression of oral cancer. So the activity of telomerase is an early molecular marker of carcinogenesis.
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Key words：carcinogenesis telomerase activity cheek pouch▲
近年來的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞的增殖與凋亡受染色體末端結(jié)構(gòu)端粒長(zhǎng)度控制,當(dāng)端粒長(zhǎng)度縮短到一定時(shí),染色體穩(wěn)定性降低,可能出現(xiàn)融合、重組甚至分解,導(dǎo)致細(xì)胞停止分裂增殖而進(jìn)入凋亡。而端粒酶是一種能添加端粒DNA重復(fù)序列至染色體末端的核糖核酸蛋白酶,它具有類似逆轉(zhuǎn)錄酶功能,可以自身RNA為模板合成端粒DNA重復(fù)序列,并轉(zhuǎn)接到染色體3′末端,維持端粒長(zhǎng)度[1,2]。研究表明,大多數(shù)正常組織和體細(xì)胞內(nèi)端粒酶活性難測(cè)到(陽性率僅4%左右)。但端粒酶與惡性腫瘤發(fā)生有密切相關(guān)性。Kim等[3]和Counter等[4]研究報(bào)道，112種惡性腫瘤細(xì)胞株和腫瘤組織端粒酶活性陽性率高達(dá)85%以上。在正常細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中，細(xì)胞端粒長(zhǎng)度明顯縮短，而端粒酶激活使染色體端粒穩(wěn)定地維持在一定長(zhǎng)度，導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞無限增殖，成為永生不死細(xì)胞(immortal cell)。目前對(duì)于端粒酶激活以及調(diào)控機(jī)理還認(rèn)識(shí)不清。1994年Kim等[3]首次報(bào)道了結(jié)合PCR技術(shù)測(cè)端粒酶活性的端粒重復(fù)序列擴(kuò)增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP),這使測(cè)定各種組織端粒酶活性成為可能。本研究首次應(yīng)用PCR-TRAP法結(jié)合ELISA分析法，半定量測(cè)定金黃地鼠頰囊癌變過程中的端粒酶動(dòng)態(tài)改變，結(jié)合端粒長(zhǎng)度變化，分析和了解端粒酶在癌變過程中的作用，并為進(jìn)一步研究針對(duì)端粒酶的腫瘤基因治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
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1 材料和方法
1.1 主要試劑與設(shè)備
二甲基苯并蒽(DMBA,Sigma公司,美國(guó)),5′-(CCCTAA)4-3′寡核苷酸探針(北京賽百盛公司),考馬斯亮藍(lán)染料(Sigma公司),端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)藥盒(Boehringer Mannheinn公司),GeneAmp PCR 9600 Thermal Cycler(BIO-RAD公司),SHZ-22水浴恒溫振蕩器(江蘇省太倉(cāng)醫(yī)療器械廠),EL312 microplate Bio-Kinetics reader(美國(guó))。
1.2 金黃地鼠頰囊癌變動(dòng)物模型建立
用DMBA誘導(dǎo)，參見參考文獻(xiàn)[5]。
1.3 金黃地鼠頰囊粘膜組織端粒長(zhǎng)度測(cè)定
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Southern雜交法參見參考文獻(xiàn)[5]。
1.4 金黃地鼠頰囊粘膜組織端粒酶活性檢測(cè)
1.4.1 原理 考馬斯亮藍(lán)染色確定檢測(cè)樣本含端粒酶蛋白量，利用端粒酶具有逆轉(zhuǎn)錄功能，作用其底物(telomerase substrate，TS)，合成端粒重復(fù)序列TTAGGG，以此作為數(shù)目不等的模板，再經(jīng)PCR循環(huán)擴(kuò)增，放大端粒酶功能活性，用高靈敏度、非放射性的ELISA方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物量，設(shè)定陽性和陰性對(duì)照,以O(shè)D值作比較，判定端粒酶活性。
1.4.2 操作步驟 按端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)藥盒說明進(jìn)行，檢測(cè)樣本端粒酶蛋白量確定為1 μg/μl，在EL312e Microplate讀數(shù)儀上測(cè)定OD值，以此判定端粒酶活性。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所測(cè)定的數(shù)據(jù),采用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行各組差異分析,采用線性回歸進(jìn)行相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
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2 結(jié) 果
2.1 金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒酶動(dòng)態(tài)變化觀察
金黃地鼠頰囊癌變過程中不同時(shí)期的端粒酶活性O(shè)D值結(jié)果見表1。每次檢測(cè)以藥盒提供的陽性對(duì)照(胚胎腎細(xì)胞株HEK293細(xì)胞)和煮沸法產(chǎn)生的陰性對(duì)照做ELISA檢測(cè)顯色反應(yīng)，其OD值分別為：0.580±0.015和0.046±0.00352以此作端粒酶活性陰陽性標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)樣本OD值除以陰性對(duì)照OD值大于等于2時(shí)判定為陽性例，并以樣本OD值除以陽性對(duì)照OD值計(jì)算相對(duì)端粒酶活性值，其結(jié)果見表2。
表1 地鼠頰囊癌變過程中不同時(shí)期的
端粒酶活性O(shè)D值 組別
例
數(shù)
, http://www.www.srpcoatings.com 涂藥側(cè)
自身對(duì)照側(cè)
范圍
±s范圍
±s第7周
6
0.161
～0.441
0.318
±0.124
0.089
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～0.097
0.093
±0.004
第10周
6
0.400
～0.876
0.603
±0.189
0.090
～0.106
0.098
±0.0035
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第14周
6
0.679
～1.337
1.085
±0.245
0.085
～0.095
0.091
±0.0025
第20周
6
0.623
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～1.118
0.869
±0.213
0.094
～0.103
0.097
±0.0043
表2 地鼠頰囊癌變過程中相對(duì)端粒酶活性值 組別
陽性例數(shù)
相對(duì)端粒酶活性值(
±s)涂藥側(cè)
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自身對(duì)照側(cè)
涂藥側(cè)
自身對(duì)照側(cè)
第7周
1
0
0.438±0.175
0.159±0.0037
第10周
3
1
0.919±0.142
0.165±0.0310
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第14周
6
0
1.771±0.217
0.150±0.0023
第20周
6
1
1.398±0.194
0.163±0.0041
2.2 金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒長(zhǎng)度變化與端粒酶活性觀察
金黃地鼠頰囊癌變過程中端粒長(zhǎng)度變化、長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性結(jié)果見表3。把癌變過程中,涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度與端粒酶活性做相關(guān)分析可得到兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9654),涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性相關(guān)分析,可得到兩者呈正相關(guān)(r=0.9471)。表3 地鼠誘癌過程中各組涂藥側(cè)端粒長(zhǎng)度、長(zhǎng)度縮短速率與端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果 組別
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TRF平均長(zhǎng)度
(
±s,kb)長(zhǎng)度縮短速率
相對(duì)端粒酶活性
(
±s)第7周
13.2±1.93
0.1372
0.438±0.142
第10周
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12.3±1.75
0.1745
0.919±0.172
第14周
8.3±2.72
0.3985
1.771±0.271
第20周
10.7±2.34
0.1445
1.398±0.194
3 討 論
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1994年Kim首創(chuàng)高靈敏度的端粒酶重復(fù)擴(kuò)增法，使人們有可能更多地注意到了端粒酶與腫瘤發(fā)生的關(guān)系，也使Harley等[6]1990年提出的“端粒假說”成為癌變機(jī)制的重要理論假說有了一系列可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)。假說認(rèn)為端粒酶的活化是細(xì)胞走向永生化必需條件，即為惡性腫瘤形成的必需步驟，因此研究癌變過程中組織端粒酶的變化顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)研究了較為理想的一種口腔癌變動(dòng)物模型的端粒酶活性變化，首次探討了端粒酶與口腔癌變機(jī)理的關(guān)系。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示正常金黃地鼠頰囊粘膜組織內(nèi)也呈現(xiàn)出一定水平的端粒酶活性，相當(dāng)于HEK293細(xì)胞陽性對(duì)照的16%左右。Bacchetti等[7]采用實(shí)驗(yàn)用大鼠的正常腺體、肝、腎等做端粒酶檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)有一定端粒酶活性存在，并認(rèn)為這與這些鼠組織細(xì)胞增生活躍有關(guān)。而頰囊粘膜細(xì)胞也具有高度分裂增殖和不斷更新的能力，它們可表達(dá)一定水平的端粒酶，說明端粒酶對(duì)細(xì)胞增生、發(fā)育起重要調(diào)控作用。為了客觀地分析端粒酶在DMBA誘發(fā)的金黃地鼠頰囊癌變過程中的變化，作者設(shè)定了涂藥對(duì)側(cè)為自身對(duì)照，消除正常粘膜細(xì)胞本身的端粒酶活性表達(dá)的影響，使結(jié)果可靠。
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本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用端粒酶PCR-ELISA檢測(cè)法，半定量地測(cè)定端粒酶活性。此方法比現(xiàn)有常用的Kim端粒重復(fù)擴(kuò)增法具有一定優(yōu)點(diǎn)，如靈敏度與同位素的TRAP法相當(dāng)，但無使用同位素的危險(xiǎn)，節(jié)省試劑和時(shí)間，減少污染機(jī)會(huì)，是一高靈敏度的非放射性光度酶免疫檢測(cè)方法。用此方法檢測(cè)的端粒酶在金黃地鼠頰囊癌變過程中的結(jié)果表明，隨著頰囊粘膜組織細(xì)胞的分裂增殖和異常增生，端粒酶活性逐步升高，與自身對(duì)照比較有顯著差異，涂藥側(cè)明顯高于對(duì)照側(cè)(P<0.05)。當(dāng)誘癌過程進(jìn)入第14周非典型增生和原位癌期，其端粒酶活性水平為最高，達(dá)到HEK293細(xì)胞的177%，癌形成期次之，而第7周單純?cè)錾诙肆Ｃ富钚猿嗜蹶栃裕贿_(dá)到HEK293細(xì)胞的43.8%，這說明端粒酶在誘癌過程后期變化明顯。酶活性水平較高，也表明此期間頰囊粘膜組織內(nèi)端粒酶陽性表達(dá)細(xì)胞增多，而這一細(xì)胞亞群就具備了進(jìn)一步分裂增殖向永生化發(fā)展(即惡性轉(zhuǎn)化)的必需條件，正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變。Bednarek等[8]在用TAP誘發(fā)鼠皮膚乳突狀瘤的動(dòng)態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)初期(10周)，11例中僅有1例表達(dá)端粒酶活性，而20周后，表達(dá)端粒酶活性的例數(shù)增多，到30周達(dá)到100%。他們這一結(jié)果與誘導(dǎo)組織細(xì)胞的組織病理學(xué)改變有關(guān)，在初期細(xì)胞處于整二倍體，分化較好時(shí)，細(xì)胞分裂增殖有序，當(dāng)細(xì)胞成為非整倍體細(xì)胞異常增生時(shí)，則端粒酶活性水平逐漸增高，而端粒酶的活化可快速形成補(bǔ)充細(xì)胞染色體端粒DNA重復(fù)片段，維持端粒一定長(zhǎng)度，促使細(xì)胞進(jìn)入無限增殖。
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本實(shí)驗(yàn)研究還將地鼠頰囊癌變中粘膜組織端粒長(zhǎng)度的動(dòng)態(tài)變化與端粒酶活性變化進(jìn)行相關(guān)分析研究。結(jié)果表明：相互對(duì)應(yīng)的誘癌時(shí)期內(nèi)，端粒長(zhǎng)度縮短與端粒酶活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.9654)，但其端粒長(zhǎng)度縮短的速率卻與端粒酶活性表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.9471)，這證明在金黃地鼠頰囊粘膜細(xì)胞中端粒長(zhǎng)度改變的調(diào)控,主要受端粒酶活性影響，細(xì)胞依賴于端粒酶活化使端粒維持一定長(zhǎng)度，從而具備無限增殖、逃避凋亡的能力，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為惡性細(xì)胞。結(jié)果還表明.金黃地鼠頰囊癌變過程中，端粒長(zhǎng)度變化最大期與端粒酶活性表達(dá)最高期是吻合的，都處于癌變過程的良性向惡性轉(zhuǎn)變的時(shí)期，這進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)端粒異�？s短,可引起染色體穩(wěn)定性降低，位于其上的原癌基因和抑癌基因激活、突變、缺失，導(dǎo)致端粒酶激活和表達(dá)增多，使端粒DNA得到迅速補(bǔ)充，細(xì)胞染色體趨于穩(wěn)定，分裂增殖繼續(xù)，細(xì)胞無限增殖轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，癌腫形成。因此端粒酶活性升高，亦是地鼠頰囊粘膜癌變的一個(gè)早期分子指標(biāo)。
綜上所述，DMBA誘發(fā)的金黃地鼠頰囊癌變模型中，端粒酶活性隨著誘癌時(shí)間延長(zhǎng)，組織病理學(xué)改變向惡性轉(zhuǎn)化而增高，與自身對(duì)照相比較有顯著差異。端粒酶活性升高可作為癌變的早期診斷指標(biāo)，同時(shí)也是端粒長(zhǎng)度穩(wěn)定的主要因素，因此本動(dòng)物模型可作為針對(duì)抑制端粒酶、實(shí)現(xiàn)阻斷和逆轉(zhuǎn)癌變、達(dá)到治療口腔惡性腫瘤目的的較理想模型，為深入研究、發(fā)展頭頸腫瘤的基因診斷和治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)�！�
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基金項(xiàng)目：本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào) 39670788)
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收稿日期：1998-12-01
修稿日期：1999-11-20, 百拇醫(yī)藥