香石竹查爾酮合酶基因的克隆與植物反義表達(dá)載體的構(gòu)建(1)
【中圖分類號(hào)】R943【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783(2011)06-0002-02
【摘要】根據(jù)已發(fā)表的查爾酮合酶(CHS)基因的序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以香石竹品種 Master 的總cDNA為模板,擴(kuò)增出香石竹查爾酮合酶基因全閱讀框架序列,以Pgem-T為中間載體,序列檢測的結(jié)果顯示同Henkel,J.等在NCBI的基因庫中發(fā)表的從香石竹品種“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全開放閱讀框序列一致。將序列反義克隆到雙元載體PBI-121上,并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中 ,經(jīng)PCR及酶切分析鑒定,結(jié)果表明該片段的反義序列已克隆于載體中。
【關(guān)鍵詞】查爾酮合酶 植物反義表達(dá)載體 基因克隆
花色的形成與植物體內(nèi)一類次級(jí)代謝產(chǎn)物類黃酮有關(guān)。在花色形成中起最主要作用的是花色素;ㄉ卦诨ò曛泻康脑龈呋蚪档投伎赡芨淖兓ǖ念伾玔1]。查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它催化丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酸基和對(duì)羥基苯丙烯酰輔酶A的一個(gè)乙酸基的縮合,產(chǎn)生柚配基查爾酮[2]。
, 百拇醫(yī)藥
反義RNA(Antisense RNA )技術(shù)是通過人工導(dǎo)入反義RNA,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá),從而定向控制某些生物性狀。該項(xiàng)技術(shù)在基因功能研究、惡性生長控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日漸顯著。反義RNA技術(shù)可以專一性地調(diào)節(jié)某一基因的活動(dòng),進(jìn)一步了解這個(gè)基因的作用,這對(duì)研究未知基因的功能和表達(dá)情況提供了思路和途徑,也為人類控制基因活動(dòng)提供了方法。由于反義RNA主要作用于轉(zhuǎn)錄水平,所以它可以避免二倍體生物同源基因互補(bǔ)而產(chǎn)生的困難。此外,反義RNA對(duì)基因的調(diào)節(jié)不會(huì)改變目的基因的結(jié)構(gòu),在應(yīng)用上更為安全。為此,近年來利用反義RNA技術(shù)在花卉的品質(zhì)改良上取得了很有價(jià)值的成果[3]。
在植物中,CHS組成了一個(gè)多基因家族,具有8—10個(gè)成員,位于兩個(gè)不同染色體上[4],并且其正常表達(dá)主要集中于花組織中(花冠和花藥)[5]。在本研究中,我們從特定發(fā)育階段的香石竹花瓣中通過rt-PCR方法克隆到CHS基因的cDNA序列,并以此為模板構(gòu)建了其反義基因的植物表達(dá)載體。
, 百拇醫(yī)藥
1材料和方法
1.1 材料:香石竹品種 由云南省農(nóng)科院花卉中心提供,大腸桿菌DH5a,農(nóng)桿菌LBA4404,雙元表達(dá)載體PBI-121為云南省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,克隆載體pGEM-T試劑盒,cDNA合成試劑盒購自Promega公司, 其余分子生物學(xué)試劑均購自華美生物工程公司.
2 方法
1.2.1 植物組織總RNA的提。合闶竦幕ɡ匍L到3-5厘米即將開放時(shí)將其采下,置于-700凍.藏。臨用時(shí),取1-2個(gè)這樣的花蕾用液氮研磨成粉末,根據(jù)購自Promega公司的Trizol總RNA提取試劑盒內(nèi)說明書的指示步驟:加入1 ml Trizol劇烈振蕩15 s,室溫放置5 min。后加入200 l氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫下放置3 min后于4℃,12,000×g,離心15 min。然后取上層水相,加入500 l異丙醇,室溫下放置10 min。再于4℃下,12,000×g,離心10 min。最后棄上清,沉淀用1 ml 70%的乙醇洗兩次,在超凈臺(tái)上吹干,溶于適量DEPC處理過的滅菌水中,-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>, http://www.www.srpcoatings.com
1.2.2cDNA第一鏈的合成:cDNA第一鏈的合成按照Promega公司cDNA合成試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行。以香石竹的總RNA為模板,oligo(dT)為引物,在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成cDNA第一鏈,于-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
1.2.3擴(kuò)增CHS基因序列:根據(jù) NCBI上發(fā)表的香石竹CHS基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,由上海博亞生物工程公司合成,引物序列為:ACHS5’- AAGAGCTCATGGCATCAATTGAGGA-3’ ACHSAt5’- GGTCTAGATCAACAATTCAATGGAAC-3’以合成的cDNA為模扳進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)的條件為94℃變性40秒,50℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘,共35個(gè)循環(huán)。
1.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克。簩(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,根據(jù)克隆載體pGEM-T試劑盒操作說明,在T4連接酶的作用下,將其連接于克隆載體pGEM-T上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,其后涂布于x-gal/IPTG培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。
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1.2.5克隆子的測序鑒定:挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng),送由上海博亞生物工程公司進(jìn)行測序。 將測序后含有CHS基因的菌體抽提質(zhì)粒保存。
1.2.6CHS基因植物反義表達(dá)載體的構(gòu)建:PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)在兩端加上了Sac1和Xba1酶切位點(diǎn),因此,將含有CHS基因的質(zhì)粒抽提純化好后進(jìn)行Sac1和Xba1雙酶切,將小片段回收后克隆到經(jīng)過Sac1和Xba1雙酶切的雙元表達(dá)載體PBI121的大片段上,得到CHS基因植物反義表達(dá)載體。
2 結(jié)果
2.1 在植物正常發(fā)育過程中,只有CHSA和CHSJ被表達(dá),并且這種表達(dá)限于花組織中(花冠和花藥),其中由CHSA轉(zhuǎn)錄的mRNA占總CHSmRNA的90%。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1.1kb左右的片段,將此片段回收純化后,克隆于pGEM-T載體上,挑取8個(gè)白色菌落經(jīng)測序后,得到克隆序列有1173bp,與Henkel,J.等在NCBI的基因庫中發(fā)表的從香石竹品種“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全開放閱讀框序列一致。其序列如下(劃線部分為兩端引物):
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5’-GGCATCAATTGAGGAGATTCGTCAGGCTCCAAGGGCCGATGGTCCTGCTACTATTTTGGCTATCGGTACTGCTACTCCGCCCAATGCTATCTATCAGGCAGATTATCCCGATTATTATTTTCGGGTTACTAAGAGTGAACATATGACTGAATTGAAGGAGAAATTTCGACGCATGTGCGATAAGTCGATGATCAAAAAGCGATACATGTACCTAACCGAGGAAATCCTCAAGGAGAACCCGAACTTGTGTGAGTACATGGGTTCATCTCTCGACACACGACAAGACATGGTCGTTTCGGAGGTCCCTAGGCTAGGCAAAGAAGCCGCGGTGAAGGCCATTAAGGAGTGGGGCCAACCTAAGTCCAAAATAACTCACGTTATCATGTGCACCACCTCCGGTGTCGACATGCCCGGGGCTGACTACCAGCTCACTAAGCTCCTTGGGTTGCGTCCCTCTGTCCGTCGCTTCATGCTCTACCAACAGGGTTGCTTCGCCGGGGGAACGGTTCTAAGGCTTGCTAAGGACTTGGCTGAGAACAACAAGGATGCGCGTGTCCTTGTTGTCTGTTCTGAAATCACTGCTATTTGTTTTAGGGGCCCCACCGAGGCTGCTTTGGACTCCATGGTGGGCCAAGCCCTCTTTGGGGATGGTGCTGGAGCCTTGATTGTTGGGTCGGACCCCGACTTGTCGATTGAGAGACCCCTTTTTCAAATGGCTTGGGCCGGTCAAACCCTACTCCCTGACTCCGACGGGGCTATCGACGGACACTTGCGTGAGGTGGGTCTCACTTTTCACCTGCTCAAGGACGTGCCGGGGATTATTTCGAAGAATATTACTAACGCCCTAGAGGATGCGTTCAGTCCTATCGGGGTAAGTGACTGGAACAATCTATTTTGGATCGCGCACCCTGGTGGGCCCGCAATCCTAGACCAAGTCGAGGCCAAATTGGGGCTAAAGGAAGAGAAGCTGGCAGCCACTAGGAATGTGTTGAGCGACTTTGGGAACATGTCGAGCGCGTGCGTGCTGTTCATTCTGGATGAAATGAGGAAGAAGTCGCTTAGAGACGGTGCGACCACAACAGGTGAAGGGCTCGATTGGGGTGTTCTGTTCGGGTTTGGGCCAAGTTTGACCGTCGAAACGGTCGTGCTCCACAGTGTTCCATTGAATTGTTG-3’, http://www.www.srpcoatings.com(蔡鵬 鄭月)
【摘要】根據(jù)已發(fā)表的查爾酮合酶(CHS)基因的序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,以香石竹品種 Master 的總cDNA為模板,擴(kuò)增出香石竹查爾酮合酶基因全閱讀框架序列,以Pgem-T為中間載體,序列檢測的結(jié)果顯示同Henkel,J.等在NCBI的基因庫中發(fā)表的從香石竹品種“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全開放閱讀框序列一致。將序列反義克隆到雙元載體PBI-121上,并導(dǎo)入農(nóng)桿菌中 ,經(jīng)PCR及酶切分析鑒定,結(jié)果表明該片段的反義序列已克隆于載體中。
【關(guān)鍵詞】查爾酮合酶 植物反義表達(dá)載體 基因克隆
花色的形成與植物體內(nèi)一類次級(jí)代謝產(chǎn)物類黃酮有關(guān)。在花色形成中起最主要作用的是花色素;ㄉ卦诨ò曛泻康脑龈呋蚪档投伎赡芨淖兓ǖ念伾玔1]。查爾酮合酶(chalcone synthase,CHS)是花色素合成中的一個(gè)關(guān)鍵酶,它催化丙二酰輔酶A的3個(gè)乙酸基和對(duì)羥基苯丙烯酰輔酶A的一個(gè)乙酸基的縮合,產(chǎn)生柚配基查爾酮[2]。
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反義RNA(Antisense RNA )技術(shù)是通過人工導(dǎo)入反義RNA,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)某些基因的表達(dá),從而定向控制某些生物性狀。該項(xiàng)技術(shù)在基因功能研究、惡性生長控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日漸顯著。反義RNA技術(shù)可以專一性地調(diào)節(jié)某一基因的活動(dòng),進(jìn)一步了解這個(gè)基因的作用,這對(duì)研究未知基因的功能和表達(dá)情況提供了思路和途徑,也為人類控制基因活動(dòng)提供了方法。由于反義RNA主要作用于轉(zhuǎn)錄水平,所以它可以避免二倍體生物同源基因互補(bǔ)而產(chǎn)生的困難。此外,反義RNA對(duì)基因的調(diào)節(jié)不會(huì)改變目的基因的結(jié)構(gòu),在應(yīng)用上更為安全。為此,近年來利用反義RNA技術(shù)在花卉的品質(zhì)改良上取得了很有價(jià)值的成果[3]。
在植物中,CHS組成了一個(gè)多基因家族,具有8—10個(gè)成員,位于兩個(gè)不同染色體上[4],并且其正常表達(dá)主要集中于花組織中(花冠和花藥)[5]。在本研究中,我們從特定發(fā)育階段的香石竹花瓣中通過rt-PCR方法克隆到CHS基因的cDNA序列,并以此為模板構(gòu)建了其反義基因的植物表達(dá)載體。
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1材料和方法
1.1 材料:香石竹品種 由云南省農(nóng)科院花卉中心提供,大腸桿菌DH5a,農(nóng)桿菌LBA4404,雙元表達(dá)載體PBI-121為云南省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存,克隆載體pGEM-T試劑盒,cDNA合成試劑盒購自Promega公司, 其余分子生物學(xué)試劑均購自華美生物工程公司.
2 方法
1.2.1 植物組織總RNA的提。合闶竦幕ɡ匍L到3-5厘米即將開放時(shí)將其采下,置于-700凍.藏。臨用時(shí),取1-2個(gè)這樣的花蕾用液氮研磨成粉末,根據(jù)購自Promega公司的Trizol總RNA提取試劑盒內(nèi)說明書的指示步驟:加入1 ml Trizol劇烈振蕩15 s,室溫放置5 min。后加入200 l氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫下放置3 min后于4℃,12,000×g,離心15 min。然后取上層水相,加入500 l異丙醇,室溫下放置10 min。再于4℃下,12,000×g,離心10 min。最后棄上清,沉淀用1 ml 70%的乙醇洗兩次,在超凈臺(tái)上吹干,溶于適量DEPC處理過的滅菌水中,-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>, http://www.www.srpcoatings.com
1.2.2cDNA第一鏈的合成:cDNA第一鏈的合成按照Promega公司cDNA合成試劑盒內(nèi)的說明書進(jìn)行。以香石竹的總RNA為模板,oligo(dT)為引物,在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,合成cDNA第一鏈,于-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
1.2.3擴(kuò)增CHS基因序列:根據(jù) NCBI上發(fā)表的香石竹CHS基因的cDNA序列,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,由上海博亞生物工程公司合成,引物序列為:ACHS5’- AAGAGCTCATGGCATCAATTGAGGA-3’ ACHSAt5’- GGTCTAGATCAACAATTCAATGGAAC-3’以合成的cDNA為模扳進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)的條件為94℃變性40秒,50℃退火1分鐘, 72℃延伸2分鐘,共35個(gè)循環(huán)。
1.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克。簩(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化,根據(jù)克隆載體pGEM-T試劑盒操作說明,在T4連接酶的作用下,將其連接于克隆載體pGEM-T上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞,其后涂布于x-gal/IPTG培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)。
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1.2.5克隆子的測序鑒定:挑取白色菌落進(jìn)行培養(yǎng),送由上海博亞生物工程公司進(jìn)行測序。 將測序后含有CHS基因的菌體抽提質(zhì)粒保存。
1.2.6CHS基因植物反義表達(dá)載體的構(gòu)建:PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)在兩端加上了Sac1和Xba1酶切位點(diǎn),因此,將含有CHS基因的質(zhì)粒抽提純化好后進(jìn)行Sac1和Xba1雙酶切,將小片段回收后克隆到經(jīng)過Sac1和Xba1雙酶切的雙元表達(dá)載體PBI121的大片段上,得到CHS基因植物反義表達(dá)載體。
2 結(jié)果
2.1 在植物正常發(fā)育過程中,只有CHSA和CHSJ被表達(dá),并且這種表達(dá)限于花組織中(花冠和花藥),其中由CHSA轉(zhuǎn)錄的mRNA占總CHSmRNA的90%。以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到1.1kb左右的片段,將此片段回收純化后,克隆于pGEM-T載體上,挑取8個(gè)白色菌落經(jīng)測序后,得到克隆序列有1173bp,與Henkel,J.等在NCBI的基因庫中發(fā)表的從香石竹品種“Clove Pink”花瓣中提取的CHS基因全開放閱讀框序列一致。其序列如下(劃線部分為兩端引物):
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