回\漢兩民族2型糖尿病視網(wǎng)膜病醛糖還原酶基因啟動(dòng)子區(qū)C(-106)T多態(tài)性的比較(2)
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參見(jiàn)附件(3163KB，3頁(yè))。
正常對(duì)照組(CON)：共 83例，男42例， 女41例，年齡40～70歲，以上均為健康體檢者，無(wú)糖尿病及其他自身免疫性疾病。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)Genebank提供的ALR的基因序列應(yīng)用Primer Premier引物設(shè)計(jì)軟件自行設(shè)計(jì)了引物(由寶生物工程有限公司合成)，序列為上游引物為：5′GAATCTTAACATGCTTAG 3′，下游引物為：5′GCCCAGCCCTATACCTAC 3′，特異性擴(kuò)增ALR基因包含啟動(dòng)子區(qū)C(-106)T多態(tài)的一段376 bp的DNA序列。
1.2.2 人類(lèi)基因組DNA提取采用柱式DNA提取試劑盒 (購(gòu)自上海生工生物工程有限公司) ，按照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行提取，提取后的基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br/>
1.2.3 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μl，其中包括10×PCR buffer 2.5 μl， dNTP mixture 2.5 μl， TaqDNA聚合酶2 μl(0.5 U/μl)，特異性引物各1.5 μl(2 pmol/μl)，模板DNA 2 μl， MgCl2 1.5 μl(10 mmol/μl)，不足體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足至25 μl。置PCR 2400熱循環(huán)儀(美國(guó)應(yīng)用生物公司生產(chǎn))，94℃預(yù)變性5 min，再按下列程序循環(huán)34次，即94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s；末次循環(huán)后，72℃延伸10 min。
1.2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物的限制性酶切取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10 μl，用限制性?xún)?nèi)切酶XspⅠ10 U(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)酶切，37℃孵育4 h，反應(yīng)終止后，消化片段在2%瓊脂糖凝膠上電泳，溴化乙錠(EB)染色，染色后通過(guò)法國(guó)VL凝膠成像系統(tǒng)判斷結(jié)果。
1.2.5 血糖、血胰島素、糖化血紅蛋白水平測(cè)定氧化酶法測(cè)定血糖、放免法測(cè)定血胰島素、比色法測(cè)定糖化血紅蛋白。HOMA胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)ALR基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg(H-W)遺傳平衡定律。非正態(tài)分布變量，用自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布，取其自然對(duì)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在數(shù)值表達(dá)式中還原成原值。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，基因型頻率以及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上數(shù)據(jù)均在SPSS 11.5軟件包上完成。
2 結(jié)果
2.1 基因型分析
含ALR基因C(-106)T多態(tài)的376 bp擴(kuò)增產(chǎn)物自身有一XspⅠ內(nèi)切酶的特異性識(shí)別位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生89 bp、287 bp 2條片段，C→T 變異后可產(chǎn)生一新的酶切位點(diǎn)，將287 bp 片段切為228 bp和59 bp 2個(gè)片段。經(jīng)XspⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化后，可產(chǎn)生以下三種基因型：CC型(287 bp，59 bp 2條帶)， CT型(287 bp，228 bp，89 bp，59 bp 4條帶)，TT型(228 bp，89 bp，59 bp 3條帶)。見(jiàn)圖1。
2.2 各組臨床資料比較
各組間年齡、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)， HOMA-IR、HbA1c顯著增高(P<0.05)，NDR組HDL-C低于CON組(P<0.05)，DR組LDL-C顯著高于CON組(P<0.05)。其余指標(biāo)各組間均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。
2.3 ALR基因C(-106)T多態(tài)基因型檢測(cè)
因TT型例數(shù)較少，故分析時(shí)將TT與CT型合并，ALR基因C(-106)T多態(tài)各基因型及等位基因分布頻率在對(duì)照組和2型糖尿病組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.601，P=0.058；χ2=3.428，P=0.064)；糖尿病視網(wǎng)膜病組CT/TT基因型及T等位基因頻率較無(wú)糖尿病視網(wǎng)膜病組均高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病視網(wǎng)膜病組T等位基因及CT/TT基因型分布頻率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.914，P=0.027；χ2=4.006，P=0.045)。相對(duì)危險(xiǎn)度分析發(fā)現(xiàn)，CT+TT基因型患糖尿病視網(wǎng)膜病的風(fēng)險(xiǎn)是CC基因型的2.127倍(OR=2.127，95%CI：1.010～4.478)；攜帶T等位基因患糖尿病視網(wǎng)膜病的風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因的1.962倍(OR=1.962，95%CI：1.075～3.581)(表2)。
2.4 ALR基因C(-106)T多態(tài)在回、漢兩民族2型糖尿病組間的比較
在甘肅地區(qū)67例回族2型糖尿病患者進(jìn)行ALR基因C(-106)T多態(tài)性的研究中，發(fā)現(xiàn)其中36例為CC型，22例為CT型，9例為T(mén)T型[1]，對(duì)67例回族2型糖尿病患者及83例漢族2型糖尿病患者C(-106)T基因型及等位基因分布頻率進(jìn)行比較：回族CT/TT基因型及T等位基因均高于漢族，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.049，P=0.824；χ2=0.398，P=0.528)(表3)。
3 討論
人類(lèi)ALR基因定位于染色體7q35，全長(zhǎng)約18 kb。1999年Kao YL等[2]在ALR基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的C(-106)T單堿基突變，攜帶C等位基因的1型糖尿病患者發(fā)生視網(wǎng)膜病變的危險(xiǎn)性增加。已有實(shí)驗(yàn)表明：ALR基因C-106T多態(tài)性波蘭人[3]、高加索人[4]中2型糖尿病的微血管病變有相關(guān)性。有研究表明，攜帶T等位基因是糖尿病視網(wǎng)膜病的保護(hù)性因素，而C等位基因則是糖尿病視網(wǎng)膜病的易感基因[5]。Li Q等[6]發(fā)現(xiàn)攜帶C等位基因能增加ALR mRNA的表達(dá)；而有的研究則表明[7]T等位基因與中國(guó)人糖尿病微血管并發(fā)癥密切相關(guān)。筆者對(duì)甘肅地區(qū)67例回族2型糖尿病患者進(jìn)行ALR基因C(-106)T多態(tài)性的研究，發(fā)現(xiàn)存在該位點(diǎn)多態(tài)性，且T等位基因與糖尿病視網(wǎng)膜病的發(fā)生有關(guān)[1]。
本研究采用PCR-RFLP的方法，對(duì)甘肅地區(qū)漢族人群進(jìn)行ALR基因5'調(diào)控區(qū)-336～+40的DNA片段進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)存在C、T兩種等位基因和CC、CT、TT三種基因型。正常對(duì)照與2型糖尿病患者間比較，基因型CC、CT、TT及等位基因C、T的頻率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ......
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