白花蛇舌草總黃酮的超聲提取工藝研究(2)
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2.3.2 測定波長的選擇取一定量供試品溶液和蘆丁對照品溶液，按“2.3.1”項下的方法進行顯色，以50%乙醇做空白試劑，平行操作，在400～600 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描。圖譜如圖1所示，二者的最大吸收波長均在505 nm處。因此，選擇505 nm作為測定波長。
2.3.3 標準曲線的繪制分別精密吸取對照品儲備液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 、6.0 ml，置于10 ml具塞刻度試管中，按“2.3.1”項下方法顯色，用對照品儲備液為0.0 ml的試管做空白對照，于505 nm處測定吸光度。以蘆丁對照品溶液濃度c(mg/ml)為橫坐標，吸光度A為縱坐標作圖，得回歸方程：y=11.728x-0.008 5(r=0.999 4)。結(jié)果表明，蘆丁在0.010 16～0.061 00 mg/ml濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。
2.3.4 精密度試驗取2 ml同一濃度蘆丁對照品溶液(0.101 6 mg/ml)，按“2.4“項下方法操作，測定吸光度，連續(xù)測定5次。測得吸光度值的RSD為0.37%(n=5)，結(jié)果表明，儀器精密度良好。
2.3.5 穩(wěn)定性試驗取同一份供試品溶液，按“2.4”項下方法操作，分別在0、15、20、25、30、35 min和40 min測定吸光度A，結(jié)果吸光度值的RSD為1.79%，表明供試品溶液在40 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。
2.3.6 加樣回收率試驗取5份已知總黃酮含量的白花蛇舌草粉末約0.5 g，精密稱定，分別精密加入蘆丁對照品11.76 mg(即將蘆丁對照品配制成0.588 0 mg/ml的溶液，每個試驗號精密加入對照品溶液20 ml，揮去溶劑后再加入樣品進行提取)，按供試品的制備方法操作，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為96.69%，RSD為1.34%，n=5。結(jié)果見表1。
2.4 樣品的含量測定
精密移取1 ml供試品溶液至10 ml具塞刻度試管中，按“2.3.1”項下方法顯色并進行紫外測定，將吸光度代入回歸方程計算總黃酮的含量，并計算出提取率。
總黃酮提取率(%)=(y+0.0085)×10×100/(11.728×1 000×w)×100。
式中：y為吸光度，w為白花蛇舌草粉末的取樣量。
2.5 乙醇濃度的考察
1.0 g白花蛇舌草粉末經(jīng)過石油醚脫脂2次，選擇料液比為1:20，提取時間為20 min，提取次數(shù)為2次的條件下，以乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%進行超聲提取，結(jié)果見圖2。在體積分數(shù)為70%時，提取率達到峰值，故選擇溶劑體積分數(shù)在60%～80%較為合適。
2.6 正交試驗
以乙醇濃度(A)，料液比(B)，超聲時間(C)，提取次數(shù)(D)為4個因素，每個因素選用3個水平，用L9(34)正交表進行試驗，每個試驗重復(fù)進行2次。因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3、4。
表4方差分析結(jié)果表明，各因素對試驗結(jié)果均有顯著性影響，影響大小順序為D>A>C>B。由表3中極差R可知，最佳組合為A2B2C2D3，即乙醇濃度為70%，料液比為1:20，提取時間為30 min，提取次數(shù)為3次時總黃酮的提取率最高。
2.7 最佳提取工藝條件的驗證
取供試品5份，每份約1.0 g，精密稱定。用石油醚脫脂2次后，按最優(yōu)條件A2B2C2D3平行操作，按“2.4”項下方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線方程進行計算，測得總黃酮的平均含量為2.375 6%，RSD為1.29%。結(jié)果見表5。
3 討論與結(jié)論
若采用將提取液直接濃縮蒸干，然后加水溶解上柱，發(fā)現(xiàn)會有部分脂溶性黃酮析出，使檢測結(jié)果明顯偏低。故將0.4 g聚酰胺粉末加入提取液中攪拌蒸干，使總黃酮充分吸附在聚酰胺粉末上，然后再采用干法上柱進行凈化洗脫操作[9]。白花蛇舌草含有較多的葉綠素，直接提取會干擾紫外分光光度法的測定結(jié)果。提取前先用石油醚超聲2次，可以去除大部分的葉綠素，而且可以提高總黃酮的提取率[10]。穩(wěn)定性試驗中，每隔5 min測定了樣品的吸收度，結(jié)果40 min時其吸收度降為0.447 0，并且溶液顏色已開始變淺，RSD為1.79%�？紤]到對測定結(jié)果準確性的影響，故應(yīng)在顯色后40 min內(nèi)測定。而15 min時其吸收度最大，故選擇在顯色15 min后進行測定。由于時間限制，正交試驗里的因素水平表，除了因素A(乙醇濃度)是通過單因素考察確定水平參數(shù)范圍外，B(料液比)、C(提取時間)、D(提取次數(shù))均是通過參考相關(guān)文獻制定的。在今后的工作中，可分別對各因素進行單因素考察，進一步優(yōu)化實驗結(jié)果。
本實驗通過正交試驗研究了乙醇濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)對提取白花蛇舌草總黃酮效果的影響。結(jié)果表明，最佳提取條件是：石油醚脫脂2次后，采用70%乙醇，料液比為1:20，超聲時間30 min，提取3次，其中提取次數(shù)對提取過程影響最大。該最佳工藝條件下，白花蛇舌草總黃酮的提取率為2.375 6%。超聲提取法操作簡單、快捷，能實現(xiàn)常溫提取，可應(yīng)用于白花蛇舌草總黃酮的提取。隨著臨床研究的進一步發(fā)展，白花蛇舌草總黃酮的藥理作用及作用機制，將進一步被闡釋。因而對白花蛇舌草總黃酮進行深度開發(fā)，研制新的制劑，尋找新的適應(yīng)證，將會進一步滿足臨床需求，產(chǎn)生更大的社會與經(jīng)濟效
[參考文獻]
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[2]方巖雄,張永成,陳敏敏,等.抗腫瘤藥物白花蛇舌草及其活性成分[J].中成藥,2004,26(7):577-578.
[3]王宇翎,張艷,方明,等.白花蛇舌草總黃酮的抗炎及抗菌作用[J].中國藥理學(xué)通報,2005,21(3):348-350.
[4]王宇翎,張艷,方明,等.白花蛇舌草總黃酮的免疫調(diào)節(jié)作用[J] ......
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