KSHVRTA上調(diào)宿主細(xì)胞Bcl—2表達(dá)的分子機(jī)制研究(2)
1.5 RT-PCRTRIzol(Invitrogen)法抽提細(xì)胞總RNA,用高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Applied Biosystems)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用SYBR green實(shí)時(shí)PCR試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,Bcl-2和GAPDH的引物見表1。10 μL反應(yīng)體系含5 μL Master Mix,5 μm的引物1 μL,4 μL稀釋的cDNA。反應(yīng)條件為:95℃變性5 min后95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)采集與分析使用StepOnePlus 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)。
1.6 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)
107個(gè)HEK 293細(xì)胞、DG75細(xì)胞共轉(zhuǎn)染10 μg熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和0、5、10、15、20 μg RTA表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h收獲細(xì)胞,制備細(xì)胞裂解液。向40 μL細(xì)胞裂解液中加入25 μL熒光素酶試驗(yàn)底物,使用LmaxⅡ384熒光光度計(jì)(Molecular Devices)檢測(cè)熒光水平 ......
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