TNIP1基因沉默對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B細(xì)胞上BCR、CD40基因表達(dá)的影響(2)
1.3.3病毒包裝 將293T細(xì)胞原先的培養(yǎng)基抽吸掉,然后轉(zhuǎn)為6 ml的無雙抗,無胎牛血清的純DMEM培養(yǎng)基,再放入恒溫培養(yǎng)箱中待用。將TNIP1-siRNA(設(shè)置為干擾組)、pLKO.1(設(shè)置為對照組)及包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G以3∶1的比例進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。即取兩只新的1.5 ml的EP管,分別加入2 μg TNIP1-siRNA、2 μg包裝質(zhì)粒(1500 ng psPAX2和500 ng pMD2.G)和2 μg pLKO.1和2 μg包裝質(zhì)粒,再分別加入200 μl純DMEM培養(yǎng)基。取12 μl羅氏轉(zhuǎn)染試劑于300 μl的純培養(yǎng)基(10%血清、100 U/ml雙抗青鏈霉素)中,常溫靜置6 min。將轉(zhuǎn)染的試劑稀釋液加入DNA稀釋液中,于室溫靜置20 min后,將混勻的物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中,6 h后補(bǔ)加10%胎牛血清(600 μl),1%雙抗(60 μl)。分別收集48、72、96 h的細(xì)胞上清液,再用0.22 μm的過濾器過濾后放于-20℃?zhèn)溆谩?br/>1.3.4外周血淋巴細(xì)胞的分離 向新鮮的血液中加入同等體積的PBS ......
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